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1、猪场环境大肠埃希菌耐药质粒消除研究动物医学进展,201l,32(4):36—40ProgressinVeterinaryMedicine猪场环境大肠埃希菌耐药质粒消除研究李基棕,周碧君,马拮,彭全海,高颖,张人俊,王开功,文明(1.贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025;2.贵州省动物疫病研究室,贵州贵阳550025)摘要:为了解耐药质粒消除对大肠埃希茵耐药性及其他生理特性的影响,参考前期试验分离出的8株携带aae(6')一Ib质粒耐药基因的大肠埃希茵的药敏试验.选取l株耐药性最强菌株用高温及SDS进行耐药质粒消除,PCR检测aac(6')一Ib基
2、因.结果显示,耐药质粒成功消除,耐药性消失,且细菌在不合抗生素条件下培养,耐药性消除状态可稳定遗传;但在含卡那霉素条件下连续传代,其耐药性可迅速恢复,第4代即可产生耐药性.体外生长曲线显示,耐药质粒消除株生长较快,且较早进入对数期.以上数据表明大肠埃希茵多重耐药性主要由质粒决定,研究开发新型耐药质粒消除剂对克服大肠埃希茵耐药性具有重要意义.关键词:大肠埃希茵;耐药质粒;质粒消除中图分类号:$852.615文献标识码:A文章编号:1007—5038(2011)04—0036—05大肠埃希菌(Escherichiacoli)是畜牧生产和兽医临床上最常见的病
3、原菌之一,仔猪黄白痢,水肿病和败血症等疾病都与该病原有关[1].抗生素在饲料中添加及不合理使用使细菌的耐药情况变得十分严重,且耐药性可通过质粒传导,使耐药菌株不断增多,耐药基因随着耐药质粒传播而蔓延,因此,研究其耐药机理,消除耐药性迫在眉睫[3].细菌的耐药机制十分复杂,主要包括获得外源耐药基因,改变靶位点,改变膜渗透屏障和改变药物主动外排泵机制[6].外源耐药基因的获得主要通过耐药质粒,整合子和转座子等DNA的结合传导,而由耐药性质粒通过接合,转导和转化在微生物间传播最为普遍[7吨].家畜的肠道为大肠埃希菌耐药质粒的传导提供了良好条件,耐药性在细菌间
4、散播使一部分体内正常菌群成为耐药基因库,大大增加了疾病治疗和预防难度[9].开发抗生素替代品和研究耐药性逆转剂是控制耐药性的有效对策,但药物研发需要较长周期和大量资金投人,因此,关于耐药性逆转剂的研究已成为热点.本实验室从贵州省兴义市某规模化养猪场污水样本中分离出多重耐药性大肠埃希菌,通过提取质粒,PCR检测出8株aac(6')-Ib基因阳性菌株.以1株aac(6')一Ib基因阳性菌株为试验材料,探讨质粒消除后对细菌耐药性及生长特性的影响,为进一步研究大肠埃希菌的耐药机制及研发耐药性逆转剂提供理论依据.1材料与方法1.1材料1.1.1试验菌株从猪场粪便
5、中分离的1株aac(6)-Ib基因阳性菌株,PCR可扩增出481bp的条带,用于耐药质粒消除试验.aac(6')-Ib基因阳性对照由贵州大学动物科学学院药理学实验室吕世明老师惠赠.1.1.2主要试剂PCR相关试剂均为宝生物工程(3v连)有限公司产品,普通营养琼脂培养基和8种药敏纸片为杭州微生物试剂公司产品.1.2方法1.2.1大肠杆菌的分离将样本稀释后涂于麦康凯琼脂平板,37℃培养24h.挑取红色菌落进行纯培养和生化鉴定.1.2.2耐药质粒消除采用高温一sDS法[1.]进行耐药质粒消除.将菌株接种于5mL的LB培养基中经37℃培养12h,然后接种5OL
6、增菌液于含5g/LSDS的LB培养基中,37℃培养18h,再接种50L该培养物于2mL的LB培养基中,45℃培养18h,反复高温和SDS处理.提质粒电泳检测,若质粒带未发生变化则继续消除,发生变化则用含20,ug/mL卡那霉素平板筛选质粒消除菌株,并用药敏纸片琼脂扩散法检测其耐药性,药敏试验结果判定标准见表1.收稿日期:2010—12—11基金项目:贵州省科技厅农业科技攻关项目(黔科合NY字[2009]3069号)作者简介:李基棕(1986一),男(侗族).湖南通道人,硕士研究生,主要从事动物微生物与免疫学研究.*通讯作者李基棕等:猪场环境大肠埃希菌耐
7、药质粒消除研究371.2.3耐药消除遗传稳定性试验分别将耐药质粒消除菌株在含20/~g/mL卡那霉素LB培养基中传代培养,每2代间隔进行药敏检测,跟踪其耐药变化;同时接种于不含卡那霉素LB培养基中,按5代间隔做药敏试验.1.2.4耐药质粒消除前后菌株生长曲线测定细菌体外生长曲线,分析耐药质粒消除对细菌生长特性的影响.分别取耐药质粒消除前后菌株,参照王关林等L11]的方法进行.2结果2.1耐药质粒消除结果将携带aac(6')一Ib基因的耐药菌株进行质粒消除.经过反复的高温和SDS处理后,质粒电泳图谱显示质粒条带逐渐减少,且大质粒丢失严重.PCR检测结果显
8、示不携带aac(6')一Ib-cr基因,耐药质粒成功消除(图1).2.2耐药质粒消除前后耐药性
