大肠埃希菌耐药性质粒的提取及鉴定.doc

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1、大肠埃希菌耐药性质粒的提取及鉴定作者：张帆，李菁华，史红艳，孙延波【摘要】目的检测大肠埃希菌对9种抗生素的耐药性，探讨大肠埃希菌耐药的分子机制。方法采用平皿二倍稀释法测定40株临床分离的大肠埃希菌对抗生素的敏感性，同时用碱裂解法对耐药菌株进行质粒的抽提，将得到的质粒转化至受体菌JM109进行质粒耐药性的鉴定。结果40株大肠埃希菌对头孢菌素等9种抗生素呈现出不同程度的耐药现象。对氨苄西林和青霉素的耐药性分别迗到了％和％。从两株耐药大肠埃希菌中提取出质粒，对其中一株进行转化鉴定，确定为耐药质粒，大小约为。结论临床分离大肠埃希菌对多种抗生素表现出较高的耐药性，而耐药性质粒

2、的存在是细菌产生耐药性的机制之一。【关键词】大肠埃希菌；耐药性；质粒ExtractionandidentificationofresistancObjectiveTodeteceptibilityofstraiagentsandtoexploreismofresistanceinbilityof40strainsoeplasmidsinEscherichiacoli【Abstract】cttheantibioticsusnsto9antibacterialthemolecularmechanAntibioticsusceptifisolateswerecarried

3、outbytheagardilutionDNAwereextractndRplasmidwasidentfisolatesexhibitrentantibioticsinsomntratestoampicillinandpenicillinwerereisolatedfromtwosofisolatesexhibitroticsandmolecularmedbyalkalinelysisaifiedby40strainsosistanceto9differeeextent.Theresista%and%,plasmidsofwetrainsof40strainses

4、istanceto9antibiechanismsofresistaneeinsomestrainsofweremediatedbyRplasmidinpart.［Keywords］Escherichiacoli；drugresistance；plasmid大肠埃希菌是引起呼吸道和泌尿生殖道感染的常见条件致病菌［1］。随着第三代头孢菌素的广泛应用，此类细菌表现出较严重的多重耐药性，并常导致严重的院内感染，使得抗菌感染治疗变得棘手。近年来大量文献证实了产超广谱内酰胺酶是造成大肠埃希菌对第三代头孢菌素的耐药性重要原因［2］。质粒介导的耐药性是细菌产生耐药性的原因之一，携

5、带多种耐药表型的R质粒常在某一地区流行并在一定条件下可在细菌中传播。因此，对耐药机制的研究是预防和控制细菌耐药的战略措施［3］。本研究对40株临床分离的大肠埃希菌进行了耐药性的测定，并对耐药菌株进行了质粒的提取及鉴定。1材料与方法材料菌株来源40株大肠埃希菌由临床分离并进行鉴定。大肠杆菌JM109由本实验室保存。药品和试剂氨节西林，青霉素；头抱拉定，头抱喔月亏钠，头孢哌酮钠，头孢曲松钠；红霉素；阿奇霉素；盐酸环丙沙星；酚/氯仿/异戊醇；普通营养琼脂培养基。质粒提取液：溶液I:含50mmol/L的葡萄糖，25mmo1/LTris•C1，lOmmol/LEDTA；溶液I

6、I:含/LNaOH和1%SDS;溶液III:5mol/LKAc60ml，HAc，水配置成100m1的溶液。方法药敏试验采用常规琼脂二倍稀释法检测40株大肠埃希菌对9种抗生素的最低抑菌浓度以及MIC50和MIC90。质粒DNA的提取采用碱裂解法［4］。挑取单个菌落，接种于7mlLB液体培养基中，37°C、震荡培养过夜。取培养物加入Eppendorf管中，4°C、12000Xg离心lmin,弃上清，使细菌尽可能干燥。将细菌重悬于100u1预冷的溶液I中，剧烈震荡，使菌体分散。加200yl新配制的溶液II，上下颠倒5次混匀，置冰上2min。加入150P1预冷的溶液III，

7、温和的混匀10s，置冰上5min。4°C、12000Xg离心7min,小心移出上清于另一Eppendorf管中。加入等体积的酴/氯仿/异戊醇，震荡混匀lmin，4°C、12000Xg离心5min，小心移出上清于另一Eppendorf管中。重复上一步骤再抽提1次。加入1/10体积的3mol/LNaAc混匀，再加入2倍体积的无水乙醇，_20°C沉淀30min。4°C、12000Xg离心15min，去上清，室温干燥。70°/。乙醇洗涤1次，室温干燥5min。沉淀溶于20ulTE中，震荡混匀，-20°C保存备用。感受态细胞的制备[4]从37°C过夜培养的大肠杆菌平板中挑