多重耐药大肠埃希菌耐药的分子机制研究

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1、分类号。B鲻：量UDC；曼至曼密级z公孟编号：—10299S1—014032硕士学位论文多重耐药大肠埃希菌耐药的分子机制研究STUDYONMOLECULARANTIMICROBIALI之ESISlANCEMECHANISMSOF蚤小Ⅱ，TIDRUG—RESISTANT邑S『C日ER配磁4C()卫■作者姓名：原鸿雁指导教师：许化溪教授小组成员：糜祖煌所长王胜军教授苏兆亮讲师申请学位：硕士学科专业：临床检验诊断学论文提交日期：2013年6月13日论文答辩日期：2013年6月8日学位授予单位：江苏大学学位授予日期：加I刁皋6m-7旧‘答

2、辩委员会主席：张晓膺教授评阅人：独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。签名：膨哪学位论文作者同期：沙f专年6月，二EllIIIIll[1lllllUllLllIY2294308学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构

3、送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏大学可以将本学位论文的全部内容或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密n在年解密后适用本授权书。本学位论文属于一不保密4口学位论文作者签名：只诂7岛碓指导教师签名：功哆年6月，1日艘眩湘傍年∥月日Ay江苏大学硕士学位论文摘要研究目的：为研究多重耐药大肠埃希菌的耐药机制，对临床分离的20株耐药大肠埃希菌进行相关耐药基因检测：包括22种B一内酰胺酶、15种氨基糖苷类修饰酶、7种16SrRNA甲基化酶以及11种可移动遗传元件

4、的相关基因。分析各临床分离株所带的耐药基因；观察LAP．2型13一内酰胺酶基因与11种13一内酰胺类药物水解活性的关系，及与其它常见13一内酰胺酶耐药基因的进化关系；对从20株DR．ECO检测到的基因进行聚类分析，以了解其同源性和进行耐药菌株的流行病学分析。研究方法：(1)分离菌株对药物的敏感性，采用K．B纸片扩散法测定。(2)使用PCR法检测22种B一内酰胺酶、15种氨基糖苷类修饰酶、7种16SrRNA甲基化酶以及11种可移动遗传元件基因，以获得其基因检测阳性模式。并将PCR阳性产物纯化、测序。使用测序软件Chromas分析测序

5、结果。(3)在SWISS．MODEL利用PDB数据库作同源建模，获得LAP．2型13一内酰胺酶的受体分子3D结构，使用ArgusLab4．1软件中的DOCK模块作11种13一内酰胺类药物和棒酸B一内酰胺酶抑制剂与LAP．2型B一内酰胺酶分子对接，比对各种13一内酰胺酶基因序列，并用DNAMAN软件的最大似然法进行LAP．2型B一内酰胺酶基因的进化分析。(4)将测得的13一内酰胺类、氨基糖苷类耐药相关基因以及可移动遗传元件遗传标记作为检测指标，对样本进行聚类分析。研究结果：(1)所有菌株均对亚胺培南敏感，除两个菌株对庆大霉素与阿米卡

6、星敏感、两株对氨苄西林／舒巴坦中介外，其余菌株对所有药物(除亚胺培南)均耐药。(2)在20株DR．ECO中，有18株检出13一内酰胺酶基因(共5种)，其中TEM、CTX．M．1群、LAP、LAT／CMY和OXA．1群的阳性检出率分别为50．O％、65．006、5．O％、5．O％和25．O％：18株检出氨基糖苷类修饰酶基因(共5种)，其中aac(3)．II、aac(6’)-lb、ant(3”)·I、aadA5和aph(3’)一l的阳性检出率分别为25％、25％、5％、65％和55％；l株检出rmtB型16SrRNA甲基化酶基因，阳性

7、率为5％：20多重耐药大肠埃希菌耐药的分子机制研究株均检出可移动遗传元件遗传标记(共7种)，且阳性率均在70％以上(除IS903)；其余基因型均未测出。其中一株TEM检测涵盖上游转座子解离酶tnpR序列，一株CTX-M．1群经测序比对为CTX．M．3型，一株L心经测序比对为u”．2型。(3)11种8一内酰胺类药物和1种13一内酰胺酶抑制剂，与LAP．2型13一内酰胺酶对接的结合自由能由低至高前三位为：阿莫西林、氨苄西林、头孢噻肟。结合自由能越低，酶催化效率越高，即L心．2型13一内酰胺酶催化效率最高的为阿莫西林。同时L廿．2型与其

8、它常见B一内酰胺酶分子进化分析发现，其与TEM、SHV属同一簇群。(4)20株细菌无完全相同的克隆，相互间具有不同的同源性和基因距离。研究结论：(1)通过对20株耐药大肠埃希菌的13一内酰胺酶、氨基糖苷类修饰酶、16SrRNA甲基化酶以及可移动遗传