大肠埃希菌多重耐药与ⅰ类整合子的关系

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1、大肠埃希菌多重耐药与Ⅰ类整合子的关系作者：陈婉花，伍严安，胡辛兰，吴长生，李宁【摘要】目的监测大肠埃希菌临床分离株的耐药性，了解大肠埃希菌中Ⅰ类整合子的流行情况和分子特性。方法临床分离114株大肠埃希菌经全自动细菌分析系统鉴定并检测耐药性，应用PCR法扩增质粒DNA上Ⅰ类整合子，对PCR产物进行酶切分析和DNA测序。将序列结果在GenBank中搜索，确定Ⅰ类整合子可变区基因盒的种类和排列。结果细菌耐药率>50%，且大多为多重耐药菌(耐受3种以上抗生素)。在58株细菌的质粒DNA上检测到Ⅰ类整合子序列，大小约600

2、~3500bp，各含1~3个Ⅰ类整合子。整合子中最常见的基因盒为dfrl7(甲氧苄啶耐药基因)与aadA5(链霉素、壮观霉素耐药基因)，最主要的基因盒排列为dfrl7-aadA5。绝大多数携带甲氧苄啶耐药基因盒的菌株对复方新诺明耐受，大多数携带链霉素、壮观霉素耐药基因盒的菌株对链霉素不敏感。结论目前临床分离的大肠埃希菌耐药性强，并广泛存在Ⅰ类整合子。菌株携带基因盒和耐药表型之间有较好的对应关系，基因盒介导了细菌耐药性。细菌的多重耐药率与Ⅰ类整合子的阳性率相关。【关键词】大肠杆菌O157;药物耐受性;整合子类;基因,细菌

3、;抗菌药8大肠埃希菌是引起人类感染最常见的肠杆菌科细菌[1]，其耐药形势十分严峻。细菌耐药性通常由获得耐药基因引起，耐药基因的水平传播使耐药菌株广泛流行[2]。整合子是耐药基因水平转移的主要因子，是含有位点特异重组系统和基因盒的遗传结构，也是一个基因盒整合和切除系统，包括对基因盒的捕获、切除和表达[3]。整合子根据整合酶的不同而分类，其中Ⅰ类整合子最常见，本研究分析大肠埃希菌中Ⅰ类整合子的流行情况和分子特性。　　1材料与方法　　1.1菌株于2005年10月-12月自福建省立医院各科室临床标本中分离大肠埃希菌114株，细

4、菌经全自动细菌分析系统(Vitek2，美国BioMerieux)检测并进行22种抗生素敏感性测定。对四环素、氯霉素、链霉素、萘啶酸的耐药性用纸片法测定。　　1.2方法　　1.2.1PCR试剂及反应条件用碱裂解法制备PCR模板质粒DNA，Ⅰ类整合子的引物序列：　　上游：5'-GGCATCCAAGCAGCAAG-3'8　　下游：5'-AAGCAGACTTGACCTGA-3'　　PCR反应体系：模板1μL，上下游引物(l0μmol/L)各1μL，dNTP(200μmol/L)2μL，10×buffer，MgCl2(25mmo

5、l/L)2.5μL，TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.125μL，超纯水17.375。反应条件：预变性94℃6min→变性94℃30s→退火60℃1min→72℃2min，35个循环;延伸72℃10min。对扩增产物进行琼脂糖电泳检测。　　1.2.2限制性内切酶反应HinfI(10U/μL,TakaRa)，酶切反应体系：PCR产物6μL，10×酶切缓冲液1μL，Hinfl(10U/μL)0.5μL，超纯水2.5μL。37℃反应14h，加入1μL10×酶切缓冲液终止反应，对酶切产物进行琼脂糖电泳检测。　　1.2.3PC

6、R产物测序PCR产物的纯化及测序由大连宝生物工程有限公司完成。　　1.3统计学处理数据以SPSS11.5统计软件处理，采用χ2检验，细菌多重耐药率和整合子阳性率进行显著性检验，P<0.05为差别有统计学意义。　　2结果　　2.1大肠埃希菌的鉴定和药敏8114株大肠埃希菌经BioMerieux全自动细菌分析仪鉴定，对26种抗生素的敏感性试验结果分析，细菌对其中12种抗生素的耐药率>50%，耐药率高的抗生素包括氨苄青霉素(100%)、复方新诺明(80%)、氨苄西林/舒巴坦(80%)、左旋氧氟沙星(64.8%)庆

7、大霉素(60%)等;中介率最高的为妥布霉素(40%);敏感率最高的是亚胺硫霉素(亚胺培南，100%)。　　2.2Ⅰ类整合子的检测结果对114株大肠埃希菌进行Ⅰ类整合子的扩增，阳性58株，PCR产物的大小分别为600，1000，1600，2000，2500，3500bp各株细菌含1～3个Ⅰ类整合子。根据各株细菌质粒DNA上检测到Ⅰ类整合子的大小和数目，细菌质粒DNA上的整合子可分为10种整合子谱(表1，图1)。表1Ⅰ类整合子谱　　1-9:不同类型的Ⅰ类整合子;10:200bpDNAladder　　2.3Ⅰ类整合子中基因盒

8、分析选择600，1000，1600，2000bp的Ⅰ类整合子送公司进行纯化及测序。将测序结果在GenBank中用Blastn进行核酸序列搜索，各整合子中所含基因盒种类和排列见表2。600，1000，1600bp整合子序列与GenBank中序列号为AY748452.1、AB154408.1、DQ663488的核酸序列相同。表2各整合