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1、牛乳中乳脂、酪蛋白和乳糖的分离鉴定2010年第11期(总第135期)大众科技DAZHONGKEJNo.11.2010(CumulativelyNo.135)牛乳中乳脂,酪蛋白和乳糖的分离鉴定武莹浣''2(1.武汉软件工程职业学院,湖北武汉430205;2.武汉广播电视大学,湖北武汉430205)【摘要】牛乳中乳脂,酪蛋白和乳糖的分离鉴定作为高职高专食品生物化学教学的综合实训项目,涵盖方法技术多样,培养学生各项技能.这个系列实训项目包括:用有机溶剂二氯甲烷萃取牛乳中乳脂并蒸馏分离.脱乳脂的牛乳的用等电点沉淀分离
2、得酪蛋白,以醋酸纤维薄膜电泳鉴定,双缩脲法测定其纯度.分离酪蛋白后所得乳清液,通过加入乙醇,浓缩,结晶制取乳糖,生成糖脎,观察糖脎结晶形状证实乳糖的存在.【关键词】乳脂;酪蛋白;乳糖;分离;鉴定【中图分类号】TS252.1【文献标识码】A【文章编号】1008—1151(2010)1卜0105—02牛乳中含有丰富的蛋白质,脂肪,碳水化合物,矿物质及维生素,成分齐全,容易消化,风味香甜,倍受人们的青睐."牛乳中乳脂,酪蛋白和乳糖的分离鉴定"可作为高职高专食品生物化学教学中代表性的综合实训项目,涵盖了萃取,沉淀和蒸
3、馏分离法,分光光度法,电泳和重结晶等多项技术内容,可深化对理论知识理解,培养各项操作技能,经多年实践效果显着,其主要实训内容介绍如下.(一)牛乳中的乳脂1.乳脂的分离牛乳中的脂肪主要是乳脂,属三磷酸甘油脂类.多数由C4~C6饱和脂肪酸生成,全乳中约含4%脂肪,乳脂以直径为0.1～10um很小的脂肪球分散于水中,因此乳中的脂肪更易消化.乳脂易溶于二氯甲烷和石油醚,因此可用二氯甲烷或石油醚萃取,蒸馏分离,测定其含量.称取全脂奶粉2O克,加入100毫升的二氯甲烷,在不断的搅捧下加热至沸2~3分钟,趁热真空抽滤,将过
4、滤的沉淀物自然干燥,备用于酪蛋白和乳糖的分离:滤液则倒入已烘干至恒重,并记录重量的蒸馏烧瓶中,加热至约4O℃,蒸馏回收二氯甲烷,此时电热套电压设定100伏,速度不要过快,至二氯甲烷完全蒸完,冷却,洗净瓶的外壁,放入105℃的烘箱烘干恒重,称量,计算乳脂的得率.2.讨论(1)二氯甲烷是不可燃低沸点溶剂,常用来代替易燃的石油醚和乙醚等,但易挥发,蒸馏时注意密闭和尾气吸收.也可用石油醚来做此实验.(2)加热时要不断的搅拌,使二氯甲烷充分接触到奶粉,提高乳脂产率.蒸馏回收的二氯甲烷可循环使用,蒸馏时速度不宜过快,以免
5、把乳脂带出,影响产率.(二)牛乳中的酪蛋白1.酪蛋白的分离牛乳中的蛋白质主要是酪蛋白,以酪蛋白酸钙一磷酸钙复合体胶粒存在.蛋白质是两性化合物,利用加酸,达到酪蛋白等电点pH为4.6～4.8左右,胶束外的负电荷被中和,中性酪蛋白溶解度最小,沉淀析出.用乙醇,乙醚和石油醚将其中残余的脂类物质洗涤除去.蒸馏水洗涤除去可水溶性杂质如乳清蛋白,乳糖及残留的缓冲溶液.在脱去乳脂的奶粉中,加入50毫升水,搅拌使其溶解,加热至4O℃,慢慢滴加10%乙酸溶液,上层有沉淀产生,慢慢将沉淀压至烧杯底部,再继续滴加,不断用pH试纸测
6、试pH值在4.6～4.8之间,直至沉淀完全.静置冷却,倾去上层乳清液备用,剩余悬浮液离心分离lO分钟(2000转/分),倾出上层清液(合并于以上乳清液中),在乳清液中迅速加入4克碳酸钠粉末,搅拌留作分离乳糖用.用蒸馏水洗沉淀二次,搅拌,离心后弃去上层液.向酪蛋白粗产品中加人6O毫升95%乙酸,搅拌后至铺有200目的尼龙布的布氏漏斗抽滤,用乙醇和乙醚等体积混合液30ml洗涤两次,30毫升乙醚分两次洗涤.最后真空过滤得白色的酪蛋白,移至表面皿中,自然干燥,称重.(或用石油醚进一步脱脂,将酪蛋白用滤纸包裹,放入石油
7、醚中大约1小时后取出,打开滤纸让石油醚完全挥发),计算酪蛋白的含量.2.酪蛋白醋酸纤维薄膜电泳采用电泳方法鉴定酪蛋白是分离生物大分子常用的手段.利用酪白质颗粒的等电点大部分低于7,在pH8.6的缓冲液中带负电荷,在电场中向正极移动,电泳后根据酪蛋白移动快慢,染色后显出清晰三个色带.称取以上分离的酪蛋白0.5克,溶解于含0.4mol/L氢氧化钠的5毫升生理盐水中.将2厘米×8厘米的醋酸纤维薄膜浸于巴比妥缓冲液(pH8.6,离子强度0.07)中,20分钟后取出,用滤纸吸干多余缓冲液.用点样器蘸上酪蛋白溶液,于膜膜
8、麻面(距膜边端1.5厘米处)点样,使其全部渗入膜内,点样面向下,两端拉紧贴于电泳槽架的滤纸桥上,点样端在阴极,进行电泳,电压为120伏,线电流约为0.4～O.6mA/cm,时间约4060分钟.电泳结束后,取出薄膜浸入染色液(0.5克CoomassieaR250溶于1升,乙酸:甲醇:dH2o=1:5:5的溶液).染色5分钟后取出薄膜,立即浸入漂洗液(甲醇:乙酸:dH0=1:1.5:17.5)中进行漂洗
