小鼠foxp3片段的表达

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1、小鼠Foxp3片段的表达和多克隆抗体的制备*中国生物工程杂志ChinaBiotechnology,2005,25(11):27～30王弘珺1王颖超2夏雪培3彭建霞1谭获2赵勇1**（1中国科学院动物研究所生物膜与膜生物工程国家重点实验室北京100080)(2广州医学院第一附属医院血液科广州5101823北京海淀医院内分泌科北京100080）摘要克隆了小鼠Foxp3片段，采用基因重组方法，构建重组表达载体pGEX4T1Foxp3。应用在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导产生的GSTFoxp3融合蛋白免疫家兔，制备兔抗Foxp3多克隆抗体。经过ELISA检测，抗血清的效价

2、达1∶128000；采用Westernblot检测，转染Foxp3MIGR载体的Ψam细胞中表达Foxp3蛋白，而仅转染MIGR空载体的Ψam细胞中为阴性表达，表眀抗体具有特异性。关键词Foxp3CD4+CD25+T细胞多克隆抗体收稿日期：20050413修回日期：20050905*中国科学院引进海外杰出人才百人计划资助项目(2003年85号)，国家重点基础研究发展计划资助项目（2003CB515501），国家杰出青年基金资助项目(30425026)**通讯作者，电子信箱：zhaoy@ioz.ac.cnForkhead蛋白家族包括多种不同功能的转录因子，与调控发育相

3、关［1］。Foxp3蛋白是这个家族的成员，FKH区呈翼状，类似于蝴蝶形，能够结合DNA［2］。其FKH结构域靠近蛋白质的C端，可能是一种转录抑制因子。此外，该蛋白质还有一个C2H2锌指结构和一个亮氨酸拉链。实验证明，Foxp3蛋白在小鼠的胸腺和外周CD4+CD25+T细胞中特异性表达，表达量是CD4+CD25-T细胞的100倍。逆转录病毒载体Foxp3MIGR转染使CD4+CD25-T细胞转化为CD4+CD25+T细胞，并具有免疫调节作用［3］。小鼠Foxp3敲除后，缺少CD4+CD25+调节性T细胞，将患淋巴细胞增生性自身免疫性疾病［4］。可见，Foxp3为该细胞发育和发

4、挥功能所必需。本文采用基因重组技术，构建了融合蛋白表达载体pGEX4T1Foxp3，并在大肠杆菌中高效表达。然后用纯化的融合蛋白作为抗原免疫新西兰白兔，制备了兔抗小鼠Foxp3抗体，特异性强，可用于CD4+CD25+T细胞的相关研究。1材料与方法1.1材料1.1.1质粒、菌株与细胞株小鼠Foxp3MIGR/MIGR逆转录病毒载体由SakaguchiS教授（KyotoUniversity，Japan）赠送。表达载体pGEX4T1，大肠杆菌（E.coli）DH5α、BL21（DE3）及Ψam细胞株均由本实验室保存。1.1.2动物新西兰白兔，体重2.5kg，雄性，由北京

5、大学医学院动物中心提供。1.1.3主要试剂与试剂盒限制性内切酶EcoRI、XhoI和T4DNA连接酶为宝生物工程（大连）有限公司产品；质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒为博大泰克生物基因技术有限公司产品；酵母膏、蛋白胨为Oxoid公司产品；N,N′甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺、Tris、TEMED、SDS、DTT、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均为Sigma公司产品；Glutathionesepharose4B为Amershambiosciences产品；脂质体Lipofectamine2000购于Invitrogen；化学发光试剂盒为Pierce公司产品；HRP标记的羊抗兔

6、IgG为Sigma产品；其余试剂均为国产分析纯。1.2方法1.2.1小鼠Foxp3引物设计参照GenBank序列，从604位点到966位点，引物序列为：P1(含EcoRI位点)：5′CCGGAATTCGGTTGTGAGAAGGTCTTC3′，P2(含XhoI位点)：5′CCGCTCGAGTGGGAAGGAACTATTGCC3′。1.2.2小鼠Foxp3片段的克隆及大肠杆菌重组表达载体的构建以Foxp3MIGR逆转录病毒载体为模板PCR扩增Foxp3片段，长度363bp。PCR反应条件：94℃30s,56℃1min,72℃1min，30个循环周期后，72℃延伸10mi

7、n，终止反应。用EcoRI和XhoI双酶切Foxp3的PCR产物，回收，插入到表达质粒pGEX4T1的EcoRI和XhoI位点之间，获得重组质粒，测序验证基因（由上海博亚生物技术有限公司完成）。用pGEX4T1和重组质粒pGEX4T1Foxp3分别转化大肠杆菌BL21（DE3）,挑取阳性克隆，用于表达研究。2005,25(11)王弘珺等：小鼠Foxp3片段的表达和多克隆抗体的制备中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyVol.25No.1120051.2.3重组GSTFoxp3融合蛋白的