原儿茶酸对小鼠黑素瘤b16细胞酪氨酸酶活力及黑色素生成的

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1、原儿茶酸对小鼠黑素瘤B16细胞酪氨酸酶活力及黑色素生成的抑制效应杨美花1，石艳1，李智聪2，王秋红2，陈清西1*(1厦门大学生命科学学院，滨海湿地生态系统教育部重点实验室，福建厦门361005，2厦门特宝生物工程股份有限公司，福建，厦门361022)摘要：酪氨酸酶是生物体内黑色素合成的关键酶，其抑制剂有着广泛的应用前景．从天然药物的有效成分中筛选安全的酶抑制剂具有重要意义．本研究以小鼠黑色素瘤B16为模型，研究了天然药物有效成分原儿茶酸对黑色素生成和酪氨酸酶活力的影响．实验结果显示：原儿茶酸可显著降低细胞的黑素含量，浓度为10μmol/L时使黑素含量降低60%．进一步

2、研究发现，原儿茶酸对小鼠B16细胞粗提取和共培养体系中的酪氨酸酶均有较强的抑制作用．对粗提酪氨酸酶的活力半抑制浓度(IC50)约为160μmol/L,对共培养体系中酪氨酸酶活力的抑制与抑制剂浓度和作用时间有关，10μmol/L作用54h可使酪氨酸酶活力下降88%．本研究为原儿茶酸作为酪氨酸酶抑制剂的开发应用奠定了基础．关键词：B16黑色素瘤细胞；酪氨酸酶；黑素生成;原儿茶酸.中图分类号：Q356．1文献标识码：A酪氨酸酶(EC1．14．18．1，Tyrosinase)是一种结构复杂的多亚基的含铜氧化还原酶，是生物体内黑色素合成的关键酶和限速酶[1]．酪氨酸酶抑制剂在化

3、妆品、果蔬保鲜、生物农药和黑素代谢疾病等治疗方面，有巨大的应用前景[2-5]．目前，酪氨酸酶抑制剂主要通过化学合成或天然产物提取得到，需系统评价其有效性和安全性方可进入应用研究，从已通过安全性评估的药物中寻找高效的酪氨酸酶抑制剂，在实际应用中有重要的意义．原儿茶酸(3,4-二羟基苯甲酸)是许多中成药的有效成分之一，具有抗炎、神经保护、抗病毒、促进干细胞增殖分化等多种功效[6-9]，此外，原儿茶酸清除DPPH自由基能力、抑制过氧化氢自由基、清除含氮NO自由基的能力也见诸报道．在结构特点上，作为一种酚酸类的物质，与多种羟基苯甲酸类酪氨酸酶抑制剂具有相似的母核结构，这提示它

4、可能是潜在的酪氨酸酶抑制剂．与蘑菇酪氨酸酶相比，小鼠黑色素瘤B16细胞更能真实反应哺乳动物体内的酶活力变化规律．系统地研究原儿茶酸对黑色素生成和对酪氨酸酶的影响，可为开发安全高效的酪氨酸酶抑制剂提供依据．基金项目：国家自然科学基金(31071611)，福建省科技项目2010N5013，*通讯作者：陈清西chenqx@xmu．edu．cn81材料与方法1.1材料本论文研究使用的小鼠黑色素瘤B16细胞购自上海生物化学与细胞所，由本实验室液氮冻存、培养和传代；L-多巴(L-DOPA)购自Sigma公司；RPMI1640细胞培养基、胎牛血清、细胞消化液购自GIBCO公司；Tr

5、itonX-100购自Amresco公司；其它试剂为国产分析纯．1.2Brandford法测定蛋白含量参考文献[10]，并略加修改．调整反应总体积至600μL，待测样品加入量约6μL，其它反应组分按比例调整，使用酶标仪测定，595nm波长下比色，记录各管测定的光密度OD595nm，线性回归，以牛血清白蛋白为标准品制做标准曲线，计算待测样品中的蛋白含量．1.3原儿茶酸对B16细胞黑色素生成的抑制效应方法参考文献[11]，进行适当调整．采用75mL细胞培养瓶，细胞接种量约1-2×106/mL，于37℃，5%CO2浓度下培养过夜，更换含不同浓度原儿茶酸(0，1．25，2．5

6、，5和10μmol/L)的培养基后继续培养48h，消化细胞，用0．1%Ttriton-X100，100mmol/LPBS缓冲液(pH7．4)的混合液重悬细胞并计数，调整细胞浓度为7-10×106/mL．加入氢氧化钠溶液至终浓度为1mol/L，80℃裂解2h，裂解液于10000rpm/min离心10min，上清用Brandford法测定蛋白质浓度，并测定405nm吸光度，计算单位蛋白质中黑色素的含量(OD405/蛋白浓度)，与空白对照细胞的黑色素含量比较，得到相对黑色素含量(%)．1.4B16细胞酪氨酸粗酶液的提取接种小鼠B16细胞约1×105-3×105至10mLRP

7、MI1640完全培养基(含有10%胎牛血清，青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL)中，培养24-48小时后，至80%左右的细胞呈融合状态，消化收集细胞，用0．2mol/LPBS(pH6．8)缓冲液重悬细胞并计数，PBS缓冲液调整细胞浓度使细胞浓度在2-7×106/mL．取300μL细胞悬液于离心管内，迅速置液氮中速冻2min，取出，再置37℃水浴中不断振摇使其快速解冻，解冻完全，再立即置液氮中速冻，37℃水浴解冻，同法操作，共重复速冻-解冻5个循环．15000rpm/min低温离心15min，收取合并上清液即得酪氨酸酶粗提液．1.5B16细胞