gdnf基因修饰大鼠胚胎中脑神经干细胞的建立

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1、GDNF因子受体在脑神经修复临床应用中的研究本文作者武玉华徐刚（作者单位系：中华脑病康复医学会常务委员、《脑神经医学研究》杂志编委、北京高科医院脑瘫专家诊室主任、副主任）【内容摘要】研究背景：脑外源性神经因子(GDNF)对多巴胺(dopamine,DA)、酪氨酸激酶(RET)等大脑神经元有特异营养作用,可促进DA、RET等大脑发育重要神经元营养吸取、修复、激活、增殖和分化，是目前防治脑瘫病(Cerebralpalsy disease)最有前途的神经营养因子。研究目的：建立脑外源性神经因子(GDNF)

2、对大脑受损神经细胞修复机制，有效恢复脑发育功能。研究方法：将GDNF因子以FuGENEHD转染试剂介入染鼠脑神经细胞，鉴定其分化能力。研究结果：免疫细胞化学及westernblot表明，GDNF因子能正确修复染鼠受损脑神经细胞，并增殖与分化，重塑。研究价值：建立GDNF因子介入脑神经细胞修复激活机制，对进一步开展人脑受损神经治疗，健全神经组织，恢复脑瘫患者思维功能、语言功能、认知功能、行为功能、运动功能等具有重要价值。【关键词】GDNF因子介入脑受损神经修复脑瘫病防治研究GDNF生物基因治疗是目前解

3、决给药和开刀治疗脑瘫问题最有希望的方案。多巴胺(dopamine,DA)、酪氨酸激酶(RET)等神经细胞作为神经组织特异性的重要前体细胞,已广泛应用于中枢神经系统疾病的细胞和基因治疗。大脑NSCs(midbrainderivedneuralstemcells,mNSCs)具有发育分化为DA能神经元的倾向,更适用于临床介导治疗脑瘫病(Cerebralpalsy disease)。本研究选取外源性脑神经因子(GDNF)外源性,以聚合酶链式扩增相结合技术RT-PCR进行GDNF基因克隆,介导转染鼠脑试验，

4、为进一步应用其研究治疗脑瘫病(Cerebralpalsy disease)提供依据。一、研究过程1.大鼠脑神经细胞多巴胺(dopamine,DA)、酪氨酸激酶(RET)的分离培养与鉴定。　无菌解剖分离大鼠侧中脑,分离制备多巴胺(dopamine,DA)、酪氨酸激酶(RET)单细胞悬液。以2×105个/ml的密度完全培养液(DMEM/F12、1%N2、20ng/mlEGF、20ng/mlbFGF)、37℃5%CO2培养,3～4d半量换液,5～7d以1×105个/ml的密度传代。取第3代神经球进行Nes

5、tin(Abcam)免疫细胞化学鉴定。2．GDNF因子修复鼠神经元机制的建立转染前1d离心收集第3代神经球,分离制备单细胞悬液,106个/孔(2ml)接种6孔板,37℃5%CO2培养18～24h。取质粒pEGFPN1-GDNF2μg、FuGENEHD转染试剂(Roche)6μl加入100μlOpti-MEMI低血清培养基(Ivitrogen)中,充分混匀后室温静置15min形成转染复合物,将其均匀滴加于神经细胞培养基中,轻轻晃动培养板使之混合均匀。37℃5%CO2培养72h后以1×105个/ml的密

6、度传代,更换含有G418(100μg/ml,Ivitrogen)的神经细胞培养液进行筛选，荧光显微镜下观察EGFP的表达情况。3、神经细胞修复免疫细胞化学鉴定。常规提取总蛋白各60μg进行15%SDS-PAGE,电泳结束取出凝胶,用转印仪将蛋白转移在硝化纤维膜上。转移膜经5%脱脂奶粉封闭后,分别与兔抗GDNF多抗(Abcam)、HRP标记的山羊抗兔IgG(北京中杉金桥)孵育,然后与LumiGLO化学发光底物(KPL)孵育后X光片直接曝光。以神经细胞分化培养液(DMEM/F12、1%N2、1%胎牛血清

7、)重悬,接种于预先放置多聚赖氨酸包被盖玻片的培养板中,37℃5%CO2培养7d后进行β-III-Tubulin、TH、GFAP和GDNF(Abcam)免疫细胞化学鉴定。设置转染质粒pEGFPN1和不转染基因的细胞，为阴性对照。二、研究结果分析GDNF基因修复鼠脑神经细胞机制建立后12h可观察到脑神经网络发育逐渐健全。GDNF基因修饰mNSCs的诱导分化GDNF基因修饰mNPCs体外诱导分化7d后免疫细胞化学染色显示细胞可分化为β-III-tubulin免疫阳性的神经元、TH免疫阳性的DA能神经元和G

8、FAP免疫阳性的星形胶质细胞,分化后细胞仍然表达GDNF及EGFP。多巴胺(dopamine,DA)、酪氨酸激酶(RET)明显增加，在吸取、修复、激活、增殖和分化中正常生长。3分钟后EGFP阳性细胞激活、再生,5小时细胞克隆增大形成神经球，10分钟后达到顶峰。pMD19-GDNF经HindIII、BamHI双酶切后,可见652bp和2.7kb两条带,与预期结果一致。一周后，免疫细胞化学染色显示细胞呈Nestin、GDNF免疫阳性，westernblot显示GDNF基因