高效液相色谱法同时测定柑橘类果皮中柚皮苷和橙皮苷的含量

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1、高效液相色谱法同时测定柑橘类果皮中柚皮苷和橙皮苷的含量1.实验目的了解高效液相色谱仪基本结构和工作原理，以及初步掌握其通用操作技能；掌握高效液相色谱保留值定性方法和外标法的标准曲线定量方法；掌握高效液相色谱分析条件选择的依据和一般过程。2.实验原理若在高效液相色谱中固定相为非极性键合相（如辛基、十八烷基、苯基），流动相为极性溶剂，即构成反相色谱分离系统。与正相色谱系统相比，反相色谱系统的应用更为广泛。由于柚皮苷与橙皮苷在流动相很固定相中的溶解度不同，采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）可以将柑橘

2、类果皮中柚皮苷和橙皮苷与其他组分（如黄酮类化合物、类柠檬苦素、天然色素等）进行分离。在适宜、一致的色谱条件下，采用外标法，分别将柚皮苷与橙皮苷的单标样、体积不同的柚皮苷和橙皮苷混合标样进入色谱系统进行分析，测得相应的保留时间和峰面积，绘制峰面积对柚皮苷或橙皮苷进样量的标准曲线，得到相应的回归方程。在相同条件下，测定供试样品中柚皮苷和橙皮苷的峰面积，由回归方程计算得到供试样品中柚皮苷和橙皮苷的进样量，再根据柚皮苷和橙皮苷的进样量与进样体积、配制的供试样品总体积、供试样品的总质量之间的关系换算得到供试样

3、品中柚皮苷和橙皮苷的含量。3.实验仪器与试剂3.1仪器Shimadzu高效液相色谱仪（SPD-10AVP紫外-可见检测器、LC-6A高压泵、CTO-10ASVP柱温箱〈含7725i型手动进样器〉），浙大智达N2000工作站；ShimadzuUV265型紫外分光光谱仪；SartoriusCP225D型电子天平；MilliporeMilli-Q型纯水仪；SartoriusBP-20型pH计；ThermoMICROMAX型离心机；上海亚荣生RE-2000型旋转蒸发器；北京中兴伟业ZDHW型调温电热套。3.

4、2试剂乙腈为色谱纯；柚皮苷和橙皮苷对照品（Dr.Ehrenstorfer公司提供）；其余试剂均为分析纯。4.实验步骤4.1样品溶液的制备实验材料为购于雅安市市场台湾龙珠蜜柚、广西甜橙、沙糖桔、皇帝柑、椪柑以及脐橙等柑橘类水果的果皮，将上述果皮经80℃干燥后，粉碎过60目筛，保存备用。分别精密称取过筛样品0.1g用滤纸包好，置于索氏提取器中，以200mL的80%乙醇为提取溶剂，提取3h。待提取液降至室温，通过旋转蒸发器55℃浓缩至近干，用提取溶剂洗涤数次，定容至25mL容量瓶。取1.0mL至1.5mL

5、于离心管中，10000rpm/min离心10min，取上清液进行色谱分析。4.2色谱条件色谱柱：Gemini5µC18110Å，150mm×4.6mm；流动相：水∶乙腈＝80∶20，用磷酸和5%的NaOH溶液调节pH＝2.4；流动相流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：1~20μL；检测波长：283nm。4.3测定1）依次打开泵、检测器、工作站电源开关，预热15min，然后启动高压泵，设定流动相流速为1.0mL/min。待基线稳定后（约30min），开始进样。2）用柚皮苷单标样润洗过的进样

6、针吸取5μL柚皮苷单标样（浓度为0.01712mg/mL）在“Load”位置推针后，扳动手动进样阀至“Inject”位置，采集数据。数据采集至第12min左右拔出进样针，并立即洗针，防止堵塞。待出峰结束后，停止采集，保存色谱图，然后换用橙皮苷单标样（浓度为0.02074mg/mL）润洗过的进样针吸取橙皮苷单标样重复上述操作。通过以上操作分别测得柚皮苷与橙皮苷的保留时间tR和半峰宽Y1/2，用于区分后面测定结果中柚皮苷与橙皮苷的吸收峰。3）用被测样品润洗过的进样针分别吸取2.5、5、7.5、10、15

7、、20μL配制好的混合标样进样、采集数据，记录实验数据。以柚皮苷、橙皮苷的进样量X（μg）为横坐标，以相应的峰面积值Y为纵坐标，绘制标准曲线并得到回归方程。4）用被测样品润洗过的进样针分别吸取0.1098g沙糖橘、0.1021g脐橙、0.1107g柳丁、0.1022g皇帝柑、0.1052g广西甜橙、0.1048g红心甜柚的供试样品液2μL进样、采集数据，记录实验数据并根据标准曲线与标准回归方程计算得到进样中柚皮苷与橙皮苷的质量，并换算成柚皮苷和橙皮苷在供试样品中的含量。5.实验结果与分析5.1标准回

8、归方程的确定根据柚皮苷、橙皮苷单标样进样后得到的色谱图，确定柚皮苷吸收峰的保留时间为11.515min，半峰宽为0.323min，橙皮苷的保留时间为12.465min，半峰宽为0.347min。根据柚皮苷和橙皮苷混合标样进样后得到的色谱图（见图1），确定峰1为柚皮苷吸收峰，峰2为橙皮苷吸收峰。图1混合标样HPLC图21由于色谱峰的保留时间可以用于进行定性测定，色谱峰的面积可以进行定量测定，故可根据所测样品中某物质吸收峰的面积求出该物质的含量。按4.2项色谱条件，分别精