引物设计软件使用

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Real-timePCR引物设计 PCR技术原理以拟扩增的DNA分子为模板，以一对与模板5′末端和3′末端互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的原则沿模板链延伸,合成新的DNA 引物引物：人工合成的两段寡核苷酸序列1准备工作2目的基因的获取3引物设计的原则4引物设计软件的安装与使用PCR特异性：引物与靶DNA特异结合PCR灵敏性：DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸引物的定义引物的重要性合成引物的步骤引物设计是PCR技术中至关重要的一环 第一部分引物设计准备工作 常规PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析一PCR与Real-timePCR 非特异性荧光标记：1、SYBRGreen特异性荧光标记：2、TaqMan3、MolecularBeacon二Real-timePCR原理及荧光标记 1SYBRGreen法工作机理SYBRGreen能结合到双链DNA的小沟部位SYBRGreen只有和双链DNA结合后才发荧光变性时，DNA双链分开，无荧光复性和延伸时，形成双链DNA，SYBRGreen发荧光，在此阶段采集荧光信号。SYBRGreen 与目标序列互补2TaqMan法工作原理TaqMan---水解型杂交探针5′端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针 SYBRGreen法对DNA模板没有选择性----适用于任何DNA使用方便-----不必设计复杂探针非常灵敏便宜优点容易与非特异性双链/引物二聚体结合，产生假阳性但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件对引物特异性要求较高缺点对目标序列的高特异性------阴性结果确定设计相对简单------与目标序列某一区域互补重复性比较好只适合一特定的目标委托公司标记，价格较高不易找到本底低的探针Taqman法3SYBRGreen法与Taqman法比较 三常用引物设计软件的比较1.加拿大Premier公司开发2.适用：常规PCR和Real-timePCR1.ABI公司开发Real-timePCR仪器配套引物设计软件2.适用：Real-timePCR局限性：主要适用Taqman法。考虑到“探针，及探针与上下游引物的联系”！条件限制很窄Primerexpress3.0Primerpremier5.0 探讨RTA2基因mRNA表达水平与耐药性的关系Primerpremier5.0Real-timePCRSYBRGreen法四实验设计及引物设计软件的选定 第二部分目的基因序列的获取同源序列比对 一目的基因序列的获取1先查蛋白相关信息了解基因编码产物（www.expasy.org）2核酸序列信息Genebank、EBI、DDBJ3文献 引物最好在模板DNA的保守区内设计二同源性比对NCBIReferenceSequence:XM_706717.1NCBIReferenceSequence:XM_706739.1 第三部分Real-timePCR设计原则 引物设计原则一引物长度（primerlength）二产物长度（productlength）三Tm值(meltingtemperature)四碱基分布的均衡性（composition）五引物二级结构（duplexformationandhairpin）六引物3’端与引物5’端七引物的保守性与特异性 1一般为18-25bp2不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃3两条引物长度不超过4bp一引物长度 二产物长度1最佳长度：50-150bp2最好不超过400bp原因：扩增片段越短，有效扩增反应越容易实现，且较短的扩增片段也可保证分析的一致性 1Tm值在58-60℃之间2两条引物的Tm值尽量接近，相差最好不超过2℃三Tm值 1GC含量一般40-60%(45-55%)GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性GC含量太高也易于引发非特异扩增。2避免多个重复碱基，尤其是4或超过4个的G碱基3上下游GC含量需相接近四GC含量 1引物无回文对称结构，否则会形成发夹结构；2引物自身不能配对，否则易形成引物二聚体；Hairpin发夹结构Crossdimer引物二聚体五二级结构 六引物3’端与5’端1.不可修饰2.最好为C、G，不能为T1.可修饰2.稳定性高引物5’端引物3’端 1保守性：通用引物——检测同一类病原微生物尽可能多的型别2特异性：避免非特异性扩增七引物保守性与特异性 第四部分引物设计软件安装与使用 主要功能:1、即引物设计2、限制性内切酶位点分析3、DNA基元(motif)查找4、同源性分析一PrimerPremier5.0简介 二PrimerPremier5.0安装 PreimerPremier启动界面Loadsequence三PrimerPremier5.0使用介绍 1基本信息SequencenameOriginalsequenceUsethesetwobuttontotranslatetheDNAseqtoaproteinseqoraproteinseqtoaDANseq8种密码子偏好Chooseafunction 2引物设计界面FirstyoucandesigntheprimermanuallySensestrandoranti-sensestrandUsefulinformationoftheprimer 3引物搜索选项设定引物类型搜索模式5’引物位置范围3’引物位置范围产物大小范围引物长度 4搜索结果28对引物引物分值100分为满分每对引物的信息双击选中一对引物 5引物信息回到主窗口引物及产物信息是否出现hairpin,dimer,falseprimingandcrossdimer 一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有But… 6引物编辑 引物编辑EditprimerhereAnalysistheeditresultAccepttheeditresultReturntothemainwindow 四PrimerExpress3.0的使用 第五部分引物设计实例 第六部分心得体会