pcr 引物设计及软件使用技巧

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1、PCR 引物设计及软件使用技巧 张新宇，朱有康，高燕宁 （中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤研究所，北京100021） 摘要：本文旨在介绍使用软件设计PCR 引物的技巧。在PCR 引物设计原则的基础上，详 细介绍了两种常用引物设计软件的基本使用方法，并对其各自的优缺点进行了比较。一般性 引物自动搜索可采用“Premier Primer 5”软件，而引物的评价分析则可采用“Oligo 6”软件。 关键词：PCR；引物设计 中图分类号：Q524 文献标识码： 文章编号： 1 自从1985 年Karny Mullis 发明了聚合酶链式反应以来，PCR 技术已成为分子生物学研 究中使用最多、最广泛的

2、手段之一[1]，而引物设计是PCR 技术中至关重要的一环。使用不 合适的PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚 体带），不出带或出带很弱，等等。 现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得 到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。一般来说，专门进行PCR 引物设计的专业软件功能更为强大，但使用起来却不太容易。本文将就引物设计原则及软件 使用问题进行探讨。 引物设计的原则 引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避 免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非

3、目的位点引发DNA 聚合反应(即 错配)。 具体实现这3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度 （product length），序列Tm 值(melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性 (internal stability, 用∆G 值反映)，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin）的能值，在错配位点（false priming site）的引发效率，引物及产物的 GC 含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制

4、性内切酶位点， 引进突变等。根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点： 1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延 伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应[2]。 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导 致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增 加[2]。 3. 引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配 位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个

5、碱基，因此应 当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反 应失败。5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。 4. 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC 含量不能相差太大[2][5]。 5. 引物所对应模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种 方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method) [6][7]。 6. ∆G 值是指DNA 双链形成所需

6、的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定 性。应当选用3’端∆G 值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间∆G 值相对较高的引 物。引物的3’端的∆G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应[6]。 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且 降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行[8]。 8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载 体的相应序列而确定。 值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC 2 含量偏高或偏低，导致找不到各种

7、指标都十分合适的引物；在用作克隆目的的PCR 因为产 物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条 件。 引物的自动搜索和评价分析 软件的引物设计功能主要体现在两个方面：首先是引物分析评价功能，该功能只有少数 商业版软件能够做到，其中以“Oligo 6”最优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在 这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。据笔者的经验，自动搜索功能