pcr引物设计及软件使用技巧

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1、PCR引物设计及软件使用技巧2.1PrimerPremier5.0的使用技巧简介2.1.1功能有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA来设计引物，由于大多数氨基酸（20种常见结构氨基酸中的18种）的遗传密码不只一种，因此，由氨基酸序列反推DNA序列时，会遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列组成大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。遗传密码规则因物种或细胞亚结构的不同而异，比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的。“Premier”可以针对模板DNA的来源以相应的遗传

2、密码规则转换DNA和氨基酸序列。软件共给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用户选择，有纤毛虫大核（CiliateMacronuclear）、无脊椎动物线粒体（InvertebrateMitochondrion）、支原体（Mycoplasma）、植物线粒体（PlantMitochondrion）、原生动物线粒体（ProtozoanMitochondrion）、一般标准（Standard）、脊椎动物线粒体（VertebrateMitochondrion）和酵母线粒体（YeastMitochondrion）。2.1.2使用步

3、骤及技巧“Premier”软件启动界面如下其主要功能在主界面上一目了然（按钮功能如上述）。限制性酶切点分析及基元查找功能比较简单，点击该功能按钮后，选择相应的限制性内切酶或基元（如-10序列，-35序列等），按确定即可。常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到。你还可以编辑或者添加新限制性内切酶或基元。进行引物设计时，点击按钮，界面如下：6进一步点击按钮，出现“searchcriteria”窗口，有多种参数可以调整。搜索目的（SeachFor）有三种选项，PCR引物（PCRPrimers），测序引物（SequencingP

4、rimers），杂交探针（HybridizationProbes）。搜索类型(SearchType)可选择分别或同时查找上、下游引物（Sense/Anti-sensePrimer，或Both），或者成对查找（Pairs），或者分别以适合上、下游引物为主（CompatiblewithSense/Anti-sensePrimer）。另外还可改变选择区域（SearchRanges），引物长度（PrimerLength），选择方式（SearchMode），参数选择（SearchParameters）等等。使用者可根据自己的需要设

5、定各项参数。如果没有特殊要求，建议使用默认设置。然后按，随之出现的SearchProgress窗口中显示SearchCompleted时，再按，这时搜索结果以表格的形式出现，有三种显示方式，上游引物（Sense），下游引物(Anti-sense)，成对显示(Pairs)。默认显示为成对方式，并按优劣次序（Rating）排列，满分为100，即各指标基本都能达标（如下图）。6点击其中一对引物，如第1#引物，并把上述窗口挪开或退出，显示“PeimerPremier”主窗口，如图所示：该图分三部分，最上面是图示PCR模板及产物位

6、置，中间是所选的上下游引物的一些性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer），错误引发情况（FalsePriming），及上下游引物之间二聚体形成情况（CrossDimer）。当所分析的引物有这四种结构的形成可能时，按钮由变成，点击该按钮，在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有，只有6。值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度，可参考应用。在需要对引物进行修饰编辑时，如在5’端加入酶切位点，

7、可点击，然后修改引物序列。若要回到搜索结果中，则点击按钮。如果要设计简并引物，只需根据源氨基酸序列的物种来源选择前述的八种遗传密码规则，反推至DNA序列即可。对简并引物的分析不需像一般引物那样严格。总之，“Premier”有优秀的引物自动搜索功能，同时可进行部分指标的分析，而且容易使用，是一个相当不错的软件。2.2Oligo6.22使用技巧简介2.2.1功能在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分复杂，但初学者容易被其复杂的图表吓倒。Oligo5.0的初始界面是两个图：Tm图和ΔG图；Oligo

8、6.22的界面更复杂，出现三个图，加了个Frq图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。2.2.2使用（以Oligo6.22为例）Oligo6.22的启动界面如下：图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG和Frq，其中Frq是6.22版本的新功能，为邻