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时间:2019-05-21
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1、PCR引物设计及软件使用技巧*张新宇,高燕宁(中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤研究所,北京100021)摘要:本文旨在介绍使用软件设计PCR引物的技巧。在PCR引物设计原则的基础上,详细介绍了两种常用引物设计软件的基本使用方法,并对其各自的优缺点进行了比较。一般性引物自动搜索可采用“PremierPrimer5”软件,而引物的评价分析则可采用“Oligo6”软件。关键词:PCR;引物设计中图分类号:Q524TodesignPCRprimerswithOligo6andPrimerPremier5ZhangXiny
2、u,ZhuYoukang,GaoYanning(CancerInstitute,ChineseAcademyofMedicalSciences,Beijing,100021,China)Abstract:TheskillofPCRprimerdesignwithsoftwareisintroducedinthispaper.BasedontheprincipalofPCR-primerdesign,theusageoftwokindsofpopularprimer-designsoftwarewasreviewed
3、detailedly,includingtheirmerit,demeritandusageskills.ItisrecommendedthattousePremierPrimer5doestheusualautomaticprimerssearch,butOligo6primersanalysis.KeyWords:PCRprimer;design;usageskill;自从1985年KarnyMullis发明了聚合酶链式反应以来,PCR技术已成为分子生物学研[1]究中使用最多、最广泛的手段之一,而引物设计是PC
4、R技术中至关重要的一环。使用不合适的PCR引物容易导致实验失败:表现为扩增出目的带之外的多条带(如形成引物二聚体带),不出带或出带很弱,等等。现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页,得到设计好的引物,也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。一般来说,专门进行PCR引物设计的专业软件功能更为强大,但使用起来却不太容易。本文将就引物设计原则及软件使用问题进行探讨。1.引物设计的原则引物设计有3条基本原则:首先引物与模板的序列要紧密互补,其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构
5、,再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。具体实现这3条基本原则需要考虑到诸多因素,如引物长度(primerlength),产物长度1(productlength),序列Tm值(meltingtemperature),引物与模板形成双链的内部稳定性(internalstability,用∆G值反映),形成引物二聚体(primerdimer)及发夹结构(duplexformationandhairpin)的能值,在错配位点(falseprimingsite)的引发效率,引物及产物的GC含量(com
6、position),等等。必要时还需对引物进行修饰,如增加限制性内切酶位点,引进突变等。根据有关参考资料和笔者在实践中的总结,引物设计应注意如下要点:1.引物的长度一般为15-30bp,常用的是18-27bp,但不应大于38,因为过长会导致其延[2]伸温度大于74℃,不适于TaqDNA聚合酶进行反应。2.引物序列在模板内应当没有相似性较高,尤其是3’端相似性较高的序列,否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基,如GGG或CCC,也会使错误引发机率增[2]加。3.引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效
7、率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率,末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基,因此应[3][4]当避免在引物的3’端使用碱基A。另外,引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反[2]应失败。5’端序列对PCR影响不太大,因此常用来引进修饰位点或标记物。4.引物序列的GC含量一般为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC[2][5]含量不能相差太大。5.引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法,如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T),
8、在Oligo软件中使用的是最邻近法(thenearest[6][7]neighbormethod)。6.∆G值是指DNA双链形成所需的自由能,该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端∆G值较低(绝对值不超过9),而5’端和中间∆G值相对较高的引[6]物。引物的3’端的∆G值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。7.引物二聚体及
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