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1、曲霉微生物转化黄山药的研究‘摘要:报道以单一菌株纯培养的固态发酵方式,选用黑曲霉(YM33182)和微紫青霉(YM3213)分别对黄山药中药材进行微生物转化研究.采用硅胶色谱和凝胶色谱技术,从菌株YM33182转化产物中分离得到4个单体化合物,通过波谱数据分析,分别鉴定为p一胡萝卜贰(daucosterol)(I),薯裁皂昔元次皂昔元B(ProsaPogeninB)(n),薯茨皂昔(Dioscin)(m),纤细薯菠昔(Grac皿n)(W).而从菌株YM32139转化产物中分离到一个主要的化合物,鉴定为薯孩皂昔元(diosgenin).T
2、LC及HPLC分析,pr0SapogeninB在菌株YM33182转化产物中的质量分数高达10.77%;而diosgenin在菌株YM32139转化产物中的质量分数为20.85%.关键词:黄山药;曲霉;微生物转化;化合物黄山药(D如coreapanthoica)是我国特有的薯菠科、薯菠属植物.其根状茎的主要有效成分为是薯裁皂昔,具有治疗心肌缺血、抗血小板凝聚、降血脂等作用〔’,2〕.微生物转化是利用微生物生长代谢过程中产生的酶对特定底物进行结构修饰的化学反应〔3〕.微生物转化技术具有反应条件温和,程序简单,产品纯度高,不污染环境等特点,
3、展示出广阔的应用前景[’].采用生物转化的方式处理中草药,将其用于复杂天然药物的筛选和研制,并与高效快速的药物筛选手段结合,是发掘天然高效活性先导化合物的重要途径困.本文利用单一菌株的固态发酵方式,直接对中药材黄山药进行微生物转化研究,为探究黄山药有效成分的结构新颖性和多样性,发掘新型药物先导化合物,寻找防治人类疾病天然药物成分开辟又一条途径.1材料与方法1.1菌种黑曲霉A,e嗜illusni岁r(编号YM33182),分离自云南大围山土壤.微紫青霉Penieilliumjanthinellum(编号YM32139),分离自云南罗平多依
4、河杉树林土壤.2株菌均保藏于云南大学微生物研究所.1.2黄山药薯茨科植物黄山药(Dioscoreapan-thaica)的根茎干粉(〕0.216mm),云南产中药材.1.3培养基马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基,马铃薯葡萄糖液体(PDB)培养基,固体转化培养基(m(黄山药干粉):m(鲜豆渣):m(水)=1:1:0.2).1.4仪器日本EYELA旋转蒸发仪,德国Wa-ters高效液相色谱仪,BrukerAVDRX50()型核磁共振仪(TMS为内标).1.5药品和试剂薄层色谱及层析色谱柱用硅胶G(均为青岛海洋化工厂生产).乙睛(色谱纯),水
5、(超纯水),甲醇,乙醇(95%),氯仿,丙酮(均为国产化学纯).1.6微生物转化以固态发酵方式,将活化好的菌种斜面接人三角瓶中(50mLPDB培养基/250mL三角瓶),摇瓶培养48h(28士2℃,200r/min),即得一级种子.按5%一7%的接种量,取一级种子转接人500mL三角瓶内装100mLPDB培养基中,摇床培养3一4d(200“min,28土2℃),扩大为收稿日期:2007一05一20作者简介:张传会(1981一),女,硕士生,主要从事真菌资源及应用微生物学研究.通讯作者:陈有为,E一mail:ywchen@y皿.edu.c
6、n.第Sl期张传会等:曲霉微生物转化黄山药的研究二级种子.再将二级种子按7土1%接种量计接人固体转化培养基中,于28士2℃发酵12d后,即得转化产物.1.7转化产物的提取和化合物的分离纯化对转化产物采用70%乙醇浸提3次,收集合并的浸提液,过滤,滤液经真空旋转浓缩仪浓缩后,加人90%乙醇,室温下放置过夜,过滤弃沉淀物,取滤液于55℃下真空浓缩得浓缩物.以同样上述方法采用95%乙醇纯化浓缩物2次,挥弃乙醇溶剂,置60℃下干燥后,即为转化产物乙醇提取物.分别取不同菌株的转化产物乙醇提取物经硅胶柱层析分离,以氯仿、氯仿一丙酮、氯仿一甲醇梯度洗
7、脱,凝胶柱层析纯化,获得化合物I一V.1.8转化产物乙醇提取物的分析1.8.1TLC分析展开剂:v(氯仿):v(石油醚)二4:l;显色剂:乙醇一硫酸显色剂.3组对照:黄山药乙醇提取物(CK一1),薯茨皂昔元(CK-2),微紫青霉PDA发酵物(CK一3);转化产物和对照样品均为乙醇溶解,毛细管点样.1.8.2HPLC分析色谱条件:色谱柱选用Sym-metryC18柱(5拜m,4.6mmx250mm);流动相:乙睛一水(98:2);流速:1mL/min;检测波长:203nm;柱温:常温;进样量:ro拌L.分析样品制备:精确称取转化产物乙醇提
8、取物及各对照样品一定量,分别置10mL容量瓶中,甲醇定容后HPLC仪器分析.2结果与分析2.1化合物I一V的结构鉴定化合物I:白色粉末,mp283一286℃(dec),易溶于毗吮,可溶于氯仿.’HNMR(5
