质量标准中有关物质测定方法的建立

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1、药品研究及生产过程中有关物质的控制方法和要求化学二室谢沐风2005年4月1有关物质的来源原料药合成过程中带入;制剂过程中产生;或是在贮藏、运输、使用过程中产生。控制的必要性2有关物质的测定方法仪器角度：高效液相色谱法（HPLC法）、薄层色谱法（TLC法）、紫外分光光度法（UV法）、气相色谱法（GC法）、毛细管电泳色谱法（CE）等试验角度：对照品法自身（稀释）对照法归一化法3有关物质的计算方法杂质对照品法加响应因子（即重量校正因子）计算的自身对照法、不加响应因子计算的自身对照法根据不同杂质采用不同方法等。有关物质的计算方法定量检测和限度检测4高效液相色谱法（HP

2、LC法）1.色谱条件的确定（即专属性试验）专属性是提供被分析物在杂质和辅料存在时能被区分的证明，通常采用在纯物质（原料或制剂）中加入一定量的杂质或辅料，证明各杂质均可与被分析物分离。配制含有1%(w/w)浓度各中间体（即各杂质）的主成分对照品溶液作为系统适用性试验用溶液，来确证色谱条件的适用性。5专属性试验验证图谱62.检测波长的确定涉及到各被检测物质在该波长下的响应因子是否相同，即所谓重量校正因子的问题。（f=A杂质/A被测成分）选取主成分与各杂质具有相同紫外吸收的波长（f=1.0）。选取各杂质紫外吸收大于主成分紫外吸收的波长（f>1.0），这样可更加严格控

3、制杂质的限度。如选取各杂质紫外吸收小于主成分紫外吸收的波长，应必须加入重量校正因子（f<1.0），否则将得到错误的判断。目前国外有关该项研究的进展73.供试品溶液浓度的确定（灵敏度试验——最低检出量的测定）供试品溶液浓度的设定至关重要。通常其设定是依据最低检出量和最大进样量来进行的。最低检出量虽然是个绝对值，但其真正的意义确是其相对值，即相对于供试品溶液中样品浓度的多少而言。其测定方法分为直观评价法和依据信躁比两种方法。最大进样量以不断增加样品溶液浓度，直至被分析物不拖尾的浓度为准。83.供试品溶液浓度的确定设定杂质总量不得过1.0%，最低检出量通常需达到对照

4、溶液浓度的1/10~1/50（即相当于供试品溶液浓度的0.1%~0.02%）。也就是说供试品溶液的浓度至少是最低检出量的1000倍~20000倍，又由于最低检出量受各因素的不同而改变（即耐受性因数），故供试品溶液的浓度在保证不拖尾的情况下（即小于最大进样量），可在此基础上再设定的高一些，以保证该浓度可适用各种条件。93.供试品溶液浓度的确定举例说明：进样量为20μl，主成分的最低检出量为1μg/ml（以浓度表示），规定杂质限度为1%，此时供试品溶液的浓度可设定为1mg/ml~20mg/ml，或者再高一些，但始终需保持主成分峰不拖尾为准，即不超过最大进样量。拖尾

5、情况也可通过流速进行适当调节103.供试品溶液浓度的确定114.加样回收试验（即准确性试验）准确性试验可采用样品中加入已知量杂质的方式来评价。准确称量各杂质，将含有1%(w/w)浓度的各杂质加入到样品溶液中，以验证所采用的色谱条件是否可分离检出出相应的各杂质。该原理同前面所述的专属性研究是一致的。125.流速、柱温与溶剂的选择在测定时通常调节流速使主成分保留时间稍长些，且使主成分峰不拖尾即可。柱温对分离效果的影响虽有一定的影响，但不甚显著，如有柱温箱，通常设定不超过35℃。溶剂的选择应测定样品溶液在该溶剂中的稳定性来衡量，尽量勿选择挥发性强的溶剂；同时应保证对

6、照溶液的主成分峰面积精密度良好。136.积分参数的设定积分参数的设定是非常重要的。它主要由斜率(Slope)、峰宽(Width)、最小峰面积(MinArea)组成。采用自身对照法时，对照溶液与供试品溶液必须在同一斜率、峰宽下进行积分计算。这里主要是供试品溶液的最小峰面积设定，它将直接导致测定结果。设定的太小，会导致很多小峰甚至是基线漂移的小峰均被积分出作为杂质峰，从而导致杂质峰面积增加，易判断为不合格；如设定的太大，又将反应不出杂质的存在情况。146.最小峰面积的设定其设定，不是绝对值，而是相对值。英国药典中有明确的说明：凡有关物质的检测采用HPLC法测定时，

7、均规定舍弃对照溶液主峰面积几分之几的峰面积。普通样品测定时，通常为1/10~1/20（即相当于样品测定浓度的0.1%~0.05%）。如规定杂质限度为1.0%，对照溶液峰面积为10000，那么，最小峰面积可考虑设定为1000~500左右。新药稳定性考核时，可设定到0.01%的最小峰面积。同时请大家注意，在进行原料药销售与购买的合同中，为确保双方达成一致意见，此点应予以重视。157.保留时间的设定经过上述方法学认证后，确定供试品溶液的保留时间，通常以洗脱出全部杂质和经强力破坏试验出的杂质，规定至主成分保留时间的几倍为止。168.强力破坏试验水破坏取原料适量，加水溶

8、解后，在90℃放置24小时。氧化破坏取