上调p38表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性

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1、上调p38表达提高卵巢癌多细胞球体顺铂敏感性作者：项涛单位：武汉，华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤生物医学中心【摘要】目的研究p38在卵巢癌多细胞球体化疗耐药中的作用。方法构建p38正义真核表达载体,稳定转染卵巢癌细胞并三维培养形成多细胞球体，RTPCR及Westernblot分析p38表达；CCK8细胞毒性试验和流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果(1)多细胞球体p38表达低于单层细胞。（2）FACS检测转染p38真核表达载体的多细胞球体经顺铂作用后，细胞凋亡率高于转染空载体和未转染的多细

2、胞球体；（3）CCK8细胞毒性试验示转染p38真核表达载体的多细胞球体相对于转染空载体和未转染的细胞球体对顺铂敏感性更高。结论p38介导顺铂对卵巢癌化疗耐药，上调p38表达，可提高卵巢癌多细胞球体对顺铂的敏感性。【关键词】卵巢癌p38顺铂化疗耐药多细胞球体p38作为MARK家族中的一员，在细胞生长、分化、细胞周期及凋亡等过程中发挥调控作用，是细胞内重要信号转导分子。肿瘤化学治疗本质即使细胞生长受抑或凋亡，然而肿瘤细胞对化疗药物的抵抗是当今肿瘤治疗的一大难题。本试验旨在探索p38分子在卵巢癌化疗

3、耐药中的作用，为进一步阐明化疗耐药机制及提高卵巢癌对药物的敏感性提供理论依据。1材料与方法1.1细胞培养人卵巢癌细胞株A2780购自ECACC（EuropeanCollectionofCellCultures,Salisbury,UK）。细胞置于含10％胎牛血清培养液RPMI1640，于37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养。1.2试剂p38多克隆抗体购自CellSignalingTechnology,Inc.(Beverly,MA,USA)；碱性磷酸酶标记山羊抗小鼠IgG购自北京中杉试剂公司，

4、RPMI1640培养液购自Gibco公司；脂质体购自Invitrogen公司。逆转录试剂盒购自Promega公司。PCR引物由上海博亚生物技术有限公司合成。1.3方法1.3.1多细胞球体模型的建立用三维培养方法(threedimensionalculture)获得A2780多细胞球体[1]。用无血清培养液RPMI1640将琼脂糖稀释成1.5％的溶液,灭菌后在24孔板上铺一浅层，冷却后调整细胞浓度种板，约5×106/m1，0.5ml，轻轻振荡，每48h部分换液1次（2/3），5d

5、后多细胞球体形成。1.3.2构建p38正义全长真核表达载体（1）RTPCR法扩增p38全长用于扩增p38全长cDNA的引物为，上游：5′CCCAAGCTTAAAATGTCTCAGGAGAGGC3′，下游：5′GCTCTAGATCAGGACTCCATCTCTTCTT3′。5′端引入HindIII酶切位点,3′端引入XbaI酶切位点,扩增目的片段为1.3Kb。引物设计借助Oligo6.0完成。(2)限制性内切酶Hind

6、III和XbaI消化质粒pEGFPC1和p38全长cDNA（PCR产物），琼脂糖凝胶回收载体片段，PCR及酶反应产物纯化试剂盒回收目的基因片段，T4DNA连接酶将目的基因片段定向克隆至真核表达载体pEGFPC1的HindIII和XbaI位点之间，使p38基因片段插入此载体中。重组体转化大肠杆菌DH5α，筛选Kan抗性克隆，命名为pEGFPC1p38，酶切鉴定重组体；脂质体LipofectamineTM2000包裹构建好pEGFPC1p38，将A2780细胞以1×106

7、/ml接种6孔板，待其生长至70%～80%融合时开始转染,转染方法参考GibcoBRL操作手册,所用pEGFPC1p38量为4.0μg/孔，脂质体10μl/孔，孵育6h后终止转染，G418筛选后三维培养形成多细胞球体（A2780/p38细胞球）。(3)RTPCR收集细胞，提取RNA，逆转录后行PCR。引物设计：利用引物设计软件Oligo6.0自行设计。p38：5′GTCCCCAATCCCGGTCATGCT3′;5′CGTGCAAAACAC

8、ATCCTCACT3′。GAPDH：5′CCTTCACCATCTTCCAGGAG3′；5′CCTGCTTCACCACCTTCTTG3′。将反应体系置PCR扩增仪上95℃预变性5min，然后开始PCR循环：94℃1min，50℃45s，72℃1min，共30个循环，最后一个循环72℃延长10min。1.3.3Westernblot收集裂解细胞，提取蛋白，测定蛋白质浓度(考马斯亮蓝G250染料法)。脱脂奶封闭2h，在10％SDS