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1、骨髓基质干细胞治疗实验性自身免疫性神经炎的研究论文.freelentalautoimmuneneuritisbybonemarroalcellsAbstractAIM:Toinvestigatethetherapeuticeffectofbonemarroalcells(BMSCs)transplantationonexperimentalautoimmuneneuritis(EAN)andstudythepossiblemechanism.METHODS:EANmodelmunizingLearkedePKH26andinjectedintotherats’caudalvein
2、10dafterimmunization.ThetherapeuticeffectofBMSCtransplantationonEANratsent,immunohistochemicalstaining,andELISA,respectively.RESULTS:TheinjectedBMSCscouldmigratetothedemyelinatednervetissues,.freelyelinationandinflammatoryinfiltrationphocytesentalautoimmuneneuritis,EAN）的疗效以及相应的作用机制。方法:用P01801
3、99多肽与弗氏完全佐剂的混合液免疫Lee,GBS）,是临床上最常见的急性瘫痪性疾病,具有较高的致残率和病死率1,目前尚未有针对此病特异有效的治疗手段。GBS已经被公为是由CD4+T细胞介导的自身免疫性疾病,细胞因子通过改变Th1/Th2型细胞之间的平衡,主要是增强Th1型细胞的作用,在疾病损伤中发挥重要作用2。骨髓基质干细胞（bonemarrocell,BMSC）,具有很强的自我更新的能力和分化潜能。体内外实验中已发现,BMSC在不同的诱导环境中可分化成不同细胞,并具有修复各种组织缺损的能力3。本实验中利用GBS的动物模型实验性自身免疫性神经炎（experimentalautoi
4、mmuneneuritis,EAN）为研究对象,探讨了BMSC移植治疗EAN的疗效以及相应的作用机制,证实BMSC可通过修补损伤的周围神经髓鞘,影响Th1/Th2型细胞之间的平衡而发挥作用,为应用BMSC治疗GBS提供了实验依据。1材料和方法1.1材料LeAb）购自武汉博士德生物工程有限公司。小鼠抗大鼠CD4、CD8mAb购自BioLegend公司。ED1抗大鼠巨噬细胞抗体购自Serotec公司。HRP羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥公司。1.2方法1.2.1EAN动物模型的建立Lein。取沉积的细胞计数,每1×107个细胞加入0.5mLDiluentC重悬后,加入0.5mL4×10
5、-6mol/LPKH26染料,室温轻柔混合2～5min。加入等体积的小牛血清1mL终止反应,再加入等体积的DMEM培养液2mL稀释。室温下用DMEM培养液洗3次,以400g离心10min,加DMEM培养液重悬。1.2.3BMSC的回输于免疫后的第10天,治疗组的每只鼠尾静脉回输0.5～0.6mLPKH26标记的BMSC悬液（含2×106个细胞）。1.2.4细胞因子的检测于免疫后第16天发病高峰时心脏取血,离心后取血清作1∶2稀释。同时取淋巴结制成淋巴细胞悬液,加入P0180199（10mg/L）抗原刺激3d。将淋巴细胞的培养上清作1∶10稀释,用ELISA法检测血清和培养上清中I
6、FNγ、TNFα及IL4的水平。参照ELISA试剂盒说明书,除空白孔外,分别将不同浓度的标准品、待测样品加入相应的孔中,每个样品设3个复孔,于37℃孵育90min。加入生物素化的抗大鼠IFNγ、TNFα、IL4,37℃孵育60min。加入酶结合物于37℃孵箱孵育30min。避光于37℃、OPD显色剂15min,终止后测定A450值。1.2.5T细胞和巨噬细胞的免疫细胞化学染色检测于发病高峰分离出靠近脊髓腰段的坐骨神经,作冷冻组织切片（4~6μm）。以冷丙酮固定20min,加预冷的30mL/LH2O2去离子水溶液灭活内源性过氧化物酶15min,加1mL/LTritonX100溶液通
7、透组织20min,再加50mL/L马血清室温封闭组织1h。滴加小鼠抗大鼠CD4mAb7mg/L、小鼠抗大鼠CD8mAb7mg/L及1∶250ED1抗大鼠巨噬细胞抗体,于4℃孵育过夜。滴加1∶250HRP羊抗鼠IgG,室温孵育2h,加DAB显色后,再以苏木素复染。经梯度酒精脱水、二甲苯透明后,封片,观察结果。1.2.6组织病理检测取坐骨神经作石蜡切片,进行HE染色检测外周神经淋巴细胞的浸润。LFB染色检测外周神经脱髓鞘的病理改变:石蜡切片脱蜡至水,浸入LFB溶液中于37℃过夜,在0
