rapsyn转染骨髓间充质干细胞移植干预实验性自身免疫性重症肌无力的研究

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1、温州医学院硕士学位论文Rapsyn转染骨髓间充质干细胞移植干预实验性自身免疫性重症肌无力的研究姓名：付裕申请学位级别：硕士专业：神经病学指导教师：张旭2012-05-16温州医学院硕士学位论文Rapsyn转染骨髓间充质干细胞移植干预实验性自身免疫性重症肌无力的研究中文摘要目的：1．探讨提取、纯化C57BL／6小鼠骨髓问充质干细胞(BMSCs)的方法，观察BMSCs的生长状况和生物学特性；使用前期构建成功的pEGFP—N1／Rapsyn荧光真核表达质粒转染BMSCs，观察其转染效率，检测Rapsyn蛋白在靶细胞中的表达情况。2．将携带Ra

2、psyn基因的BMSCs局部注射C57BL／6小鼠双侧后肢，探讨使用乙酰胆碱受体单克隆抗体mAb35诱导EAMG小鼠模型的可行性，观察移植转染细胞对小鼠EAMG模型的成模影响，转染细胞分泌的Rapsyn蛋白对肌肉组织AChR的作用，以及BMSCs对EAMG小鼠细胞因子分泌的影响。方法：1．全骨髓贴壁培养法分离纯化C57BL／6小鼠BMSCs，在体外扩增、传代。取第3代细胞，采用脂质体介导的基因转移技术将重组pEGFP—Nl／Rapsyn质粒导入BMSCs中，G418筛选阳性表达细胞后扩增传代，荧光显微镜下观察绿色荧光，WesternBl

3、otting法检测靶细胞中Rapsyn蛋白的表达情况。2．48只C57BL／6小鼠随机分为A、B两组，每组24只，A组小鼠双侧后肢胫骨前肌及腓肠肌分8一10点注射携带Rapsyn基因的BMSCs，B组小鼠相同部位注射等量生理盐水。2周后将A、B两组小鼠再分别随机分为E组和C组，每组12只，AE、BE组小鼠经腹腔注射单克隆抗体35(mAb35)诱导EAMG动物模型，AC组和BC组小鼠经腹腔注射相同剂量的生理盐水，模型诱导后每8h观察小鼠临床症状及进行临床评分，诱导48h后取小鼠外周血，ELISA法检测各组小鼠血浆中TGF-13，IFN-y

4、，IL-4的表达水平；取血后处死各组实验动物，分离双侧后肢胫骨前肌及腓肠肌，免疫荧光染色法观察突触后膜AChR与运动终板的结合情况，RT—PCR和WesternBlotting法检测AChRamRNA和AChRa蛋白表达情况。结果：1．体外培养扩增至第3代的BMSCs纯度较高，形态均一，呈长梭形，成纤维细胞状，细胞呈漩涡状生长；pEGFP—N1／Rapsyn质粒转染BMSCs24h后即可在荧光显微镜下观察到绿色荧光，48h荧光表达量达到高峰，转染效率约为20％；WesternBlotting法检测转染质粒BMSCs有Rapsyn蛋白的稳

5、定表达，经G418筛选阳性表达细胞传代后的转染细胞仍可观察到绿色荧光，有Rapsyn蛋白表达，但蛋白表达量减低(P

6、>O．05)。免疫荧光染色结果表明，BE组与BC组相比，AChR和Rapsyn在骨骼肌的运动终板处荧光着色均减少，AC组与BC组相比，AChR和Rapsyn荧光着色均增多，AE组与BE组相比，AChR和Rapsyn荧光着色均增多，其表达量接近BC组。RT-PCR和WesternBlotting法检测结果表明，AC组与BC组相比AChRa蛋白表达量增多(PO．05)，AE组与BE组相比AChRamRNA表

7、达有降低(P

8、代偿性增加的AChRmRNA表达量，对AChR发挥保护性作用。关键词：重症肌无力；实验性自身免疫性重症肌无力；骨髓间充质干细胞；受体相关蛋白；乙酰胆碱受体温州医学院硕士学位论文Transplantation