植物不同组织可溶性蛋白提取和多肽组分差异研究

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1、植物不同组织可溶性蛋白提取和多肽组分差异研究方案可行。最好用第二个。实验目的:1、掌握冷冻离心机的操作使用方法。2、掌握植物可溶性蛋白的提取方法和原理。3、掌握分光光度计的使用方法和原理。4、掌握可溶性蛋白的定量测定方法和原理。5、掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理和基本操作过程。实验包括三个部分内容：一、植物不同组织可溶性蛋白的提取。二、植物可溶性蛋白含量的测定。三、聚丙烯凝胶电泳分离可溶性蛋白。原理:植物不同组织可溶性蛋白的提取植物材料中通常含有两类蛋白，一种是易溶于水主要存在于细胞基质、叶绿体基质和线粒体等细

2、胞器基质中的可溶性蛋白，另一类是难溶于水主要存在于各种细胞器膜上的膜结合蛋白。将植物材料在一定的提取缓冲液和0～4℃低温下充分研磨，可溶性蛋白将溶解在提取缓冲液里，通过离心将未破碎细胞器和膜蛋白去除，得到的离心上清夜就是可溶性蛋白的粗提物。　离心机基本原理⒈离心力（centrifugalforce，Fc）离心作用是根据在一定角度速度下作圆周运动的任何物体都受到一个向外的离心力进行的。离心力（Fc）的大小等于离心加速度ω2X与颗粒质量m的乘积，即：FC＝mω2X其中ω是旋转角速度，以弧度/秒为单位；X是颗粒离开旋转

3、中心的距离，以cm为单位；m是质量，以克为单位。⒉相对离心力（relativecentrifugalforce，RCF）由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力而受变化，因此在文献中常用“相对离心力”或“数字×g”表示离心力，只要RCF值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。RCF就是实际离心场转化为重力加速度的倍数RCF＝F离心力/F重力＝mω2X/mg=1.118×10－5.N.XN（rpm）=RCF×105/（1.118×X）式中X为离心转子的半径距离，以cm为单位；g为

4、地球重力加速度（980cm/sec2）；N为转子每分钟的转数（rpm）。植物细胞破碎后通过差数离心形成的沉淀沉淀转速×时间内含物A150g×20min完整细胞B1000g×20min细胞核，细胞碎片C3000g×6min叶绿体D10000g×20min线粒体、溶酶体、微体E100500g×20min微粒体F100500g×20min＋0.26%脱氧胆酸核糖体植物可溶性蛋白含量的测定考马斯亮蓝G-250（Coomassiebrilliantblue，G-250）法是利用蛋白质-染料结合的原理，定量地测定微量蛋白质浓

5、度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德瓦尔键结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质–染料复合物发生聚合并沉淀出来。此法灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍），易于操作，干扰物质少，是一种比较好的

6、定量法。其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，N—methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N¢，N¢—四甲基乙二胺(N，N，N¢，N¢—tetramethylethylenediamine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammoniumpersulfate(NH4)2S2O8，简称AP)或核黄素(ribof

7、avin即vitaminB2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，简称PAGE)。Acr和Bis的浓度、交联度可以决定凝胶的密度、粘度、弹性、机械强度以及孔径大小。100ml凝胶溶液中含有的单体和交联剂总克数为凝胶浓度，用T%表示。凝胶溶液中交联剂占单体加交联剂总量的百分数称之为交联度，用C%表示。T%＝（a+b）×100/mC%＝b×100/(a+b)式中a—Acr的质量（g）

8、；b—Bis的质量（g）；m—凝胶溶液总体积（ml）。在此，a∶b（W/W）是关键；a∶b＜10时，形成的凝胶脆、硬、呈乳白色；a∶b＞100时，即使5%的凝胶也呈糊状，易断裂。要制备透明而有弹性的凝胶，a∶b要控制在30左右。通常T=2%~5%时，a∶b=20左右；T=5%~10%时，a∶b=40左右；T=15%~20%时，a∶b=125~200左右。T在3%~25%的