不同植物样品可溶性蛋白含量和多肽组分的差异.ppt

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1、不同植物样品可溶性蛋白含量和多肽组分的差异实验目的掌握冷冻离心机的操作使用方法。掌握植物可溶性蛋白的提取方法和原理。掌握分光光度计的使用方法和原理。掌握可溶性蛋白的定量测定方法和原理。掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理和基本操作过程。实验包括三个部分内容：一、不同植物样品可溶性蛋白的提取。二、植物可溶性蛋白含量的测定。三、聚丙烯凝胶电泳分离可溶性蛋白。一、不同植物样品可溶性蛋白的提取原理植物材料中通常含有两类蛋白，一种是易溶于水主要存在于细胞基质、叶绿体基质和线粒体等细胞器基质中的可溶性蛋白，另一类是难溶于水主要存在于各种细胞器膜上的

2、膜结合蛋白。将植物材料在一定的提取缓冲液和0～4℃低温下充分研磨，可溶性蛋白将溶解在提取缓冲液里，通过离心将未破碎细胞器和膜蛋白去除，得到的离心上清夜就是可溶性蛋白的粗提物。离心机基本原理⒈离心力（centrifugalforce，Fc）离心作用是根据在一定角度速度下作圆周运动的任何物体都受到一个向外的离心力进行的。离心力（Fc）的大小等于离心加速度ω2X与颗粒质量m的乘积，即：FC＝mω2X其中ω是旋转角速度，以弧度/秒为单位；X是颗粒离开旋转中心的距离，以cm为单位；m是质量，以克为单位。⒉相对离心力（relativecentr

3、ifugalforce，RCF）由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距离不同，离心力而受变化，因此在文献中常用“相对离心力”或“数字×g”表示离心力，只要RCF值不变，一个样品可以在不同的离心机上获得相同的结果。RCF就是实际离心场转化为重力加速度的倍数。RCF＝F离心力/F重力＝mω2X/mg=1.118×10－5.N.XN（rpm）=RCF×105/（1.18×X）式中X为离心转子的半径距离，以cm为单位；g为地球重力加速度（980cm/sec2）；N为转子每分钟的转数（rpm）。植物细胞破碎后通过差数离心形成的沉淀

4、沉淀转速×时间内含物A150g×20min完整细胞B1000g×20min细胞核，细胞碎片C3000g×6min叶绿体D10000g×20min线粒体、溶酶体、微体E100500g×20min微粒体F100500g×20min＋0.26%脱氧胆酸核糖体实验注意事项：整个操作过程在0－4℃低温下进行；研磨必须充分；加蛋白酶抑止剂（PMSF苯甲基磺酸氟）或抗氧化剂；提取的蛋白一般需要分装后，在液氮或－80℃低温下保存。实验材料、试剂与仪器设备（一）实验材料自选植物材料，至少三种以上处理，例如：1、不同植物的叶片；2、同一植物的根、茎、叶

5、、花等不同组织器官；3、同一植物不同发育状态如嫩叶、成熟叶和老叶；4、或者叶片用不同的高温处理等等。（二）试剂1．提取缓冲液：0.125mol的Tris-HCl,pH7.0，称取12.5gTris于烧杯，用适量双蒸水溶解，HCl调pH至7.0,定容至1000ml。2．聚乙烯吡咯烷酮（PVP）3．β-巯基乙醇（三）设备冷冻离心机，研钵，烧杯，量瓶，移液管，试管等准确称取0.5g植物材料，加入2ml预冷的提取缓冲液，0.1g聚乙烯吡咯烷酮PVP和50μl的β-巯基乙醇，置冰浴研磨匀浆后,转移到10ml塑料离心管，用3ml提取液分两次洗涤

6、研钵，提取液总体积5ml，10000g下离心10min，上清液为可溶性蛋白的粗提液。操作步骤二、植物可溶性蛋白含量的测定原理考马斯亮蓝G-250（Coomassiebrilliantblue，G-250）法是利用蛋白质-染料结合的原理，定量地测定微量蛋白质浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德瓦尔键结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律。此染料与蛋白质结合后颜色由红色形式转变成蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的

7、增加量可知与其结合蛋白质的量。蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质–染料复合物发生聚合并沉淀出来。此法灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍），易于操作，干扰物质少，是一种比较好的定量法。其缺点是在蛋白质含量很高时线性偏低，且不同来源蛋白质与色素结合状况有一定差异。试剂与仪器设备冷冻离心机，研钵，烧杯，离心管，（二）试剂1.标准蛋白质溶液（100μg／mL牛血清白蛋白）：称取牛血清蛋白25mg，加水溶解并定容至100mL，吸取上述溶液40mL，用蒸馏水稀释至100mL即可。2

8、.考马斯亮蓝试剂：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入100mL85％（W／V）的磷酸，再用蒸馏水定容到1000mL，贮于棕色瓶中。常温下可保存一个月。（三）仪器设备分光光度计，烧杯，量瓶，移液管，试管等