人骨形成蛋白论文

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1、人骨形成蛋白论文鱼兵，范清宇，马保安，周勇，张明华，龙华，闫露【关键词】基因克隆【Abstract】AIM:ToconstructthereplicationdeficientrebinantadenovirusesAdBMP7andtoinvestigateBMP7expressionofAdBMP7inrabbitbonemarrocells(BMSc).METHODS:HumanBMP7cDNAplifiedbyRTPCRmethodfromhumanfetalkidneyandclonedintoshuttlevectortogeneratepAdT

2、rackCMVBMP7eIandthentransformedintoAdEasier1petentcellsbearingadenoviralbackboneplasmidtoobtainrebinantadenoviralplasmidpAdBMP7.Therebinantsedbyrestrictionendonucleaseanalysis.ThepAdBMP7eandtransfectedinto293cellstogetpackedadenovirusesRNAexpressionofBMP7inrabbitBMScethodandtheexpr

3、essionofgreenfluorescenceproteinicroscope.RESULTS:A1296bpcDNAplifiedbyRTPCRfromhumanfetalkidneyanditssequenceanalysisentedasexpected.TherebinantplasmidpAdBMP7ologousrebinationandconfirmedbyrestrictionendonucleasedigestion.GFPexpressioncouldbeobservedonthethirddayafterthepackingofth

4、elinearizedpAdBMP7in293cellsand3×109efu/LtiterofAdBMP7edbyRTPCRandobservedicroscope72hoursaftertherabbitBMScanBMP7geneissuccessfullyclonedanditsrebinantadenovirusesareconstructed.Ourdatamayofferanovelapproachtolocalgenetherapyofboneregeneration.【KeyanBMP7;genecloning【摘要】目的：克隆人骨形成蛋白

5、7(BMP7)基因并构建其重组腺病毒，观察其在兔BMSc中的表达.方法：用RTPCR方法从人胎肾组织中克隆人BMP7基因全长cDNA并测序；将BMP7基因cDNA克隆到穿梭载体形成转移质粒pAdTrackCMVBMP7.freeleI酶切线性化后与骨架质粒感受态细胞AdEasier1Cells经电穿孔法同源重组得到腺病毒质粒pAdBMP7并酶切鉴定，PacI酶切线性化后转染293细胞包装后获得复制缺陷型重组腺病毒AdBMP7，将AdBMP7体外感染兔BMSc后，以RTPCR方法及观察AdEasy系统上的绿色荧光蛋白表达鉴定BMP7基因的表达.结果：用RTPC

6、R方法从胎肾组织中克隆出1296bp的cDNA，测序证实为人BMP7基因；酶切鉴定表明BMP7基因已插入到pAdTrackCMV穿梭质粒且腺病毒重组质粒pAdBMP7构建成功；经293细胞包装3d后可观察到绿色荧光蛋白表达(GFP)，氯化铯梯度离心法最终获得约3×109efu/L滴度的重组病毒；体外感染兔BMSc后RTPCR方法及荧光显微镜证实BMP7基因可在兔BMSc中表达.结论：成功克隆人BMP7基因并构建其重组腺病毒，证实了其在BMSc的表达，为骨再生的局部基因治疗打下基础.【关键词】腺病毒；表达载体；人骨形成蛋白7；基因克隆0引言人骨形成蛋白7(bo

7、nemorphogeicprotein7,BMP7)又称成骨蛋白1(osteogenicprotein1,OP1)是骨形态发生蛋白家族的成员，具有广泛的生理功能及较强的骨诱导能力［1-3］.随着基因治疗技术及组织工程的发展，将成骨作用较强的诱骨因子基因导入骨髓基质干细胞期望获得BMP在局部的持续释放而发挥其诱骨作用成为骨再生及骨缺损修复的较为理想的方法.我们利用AdEasy腺病毒表达系统介导BMP7转导骨髓基质干细胞并观察其体外表达，为进一步的骨再生及骨缺损的局部基因治疗奠定良好基础.1材料和方法1.1材料AdEasy腺病毒表达由美国TongChuanHe博

8、士惠赠，人胚肾293细胞、pT7Blue测序载体、大