平肝潜阳法对高血压模型大鼠下丘脑蛋白质表达的影响论文

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1、平肝潜阳法对高血压模型大鼠下丘脑蛋白质表达的影响论文【摘要】【目的】观察平肝潜阳法对高血压肝阳上亢证模型大鼠下丘脑蛋白质表达差异的影响，从蛋白质组学水平探讨其降血压和改善肝阳上亢证症状的分子机制。【方法】选用自发性高血压大鼠（SHR）灌服附子汤法复制高血压肝阳上亢证大鼠模型，以ＳＤ大鼠作正常对照，治疗组给予天麻钩藤饮加减方灌胃给药（0.1g/mL）；采用二维凝胶电泳（2DE）分离大鼠下丘脑蛋白质，获得差异表达蛋白质；利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDITOFMS）和数据库分析鉴定差异表达蛋白质。【结果】高血压肝阳上亢证大鼠模型复制成功，其易激惹程度、饮水

2、量、收缩压等与正常组比较，差异均有显著性意义（Ｐ＜０.０１）；治疗组给予中药天麻钩藤饮加减方治疗后，易激惹程度好转.freelin，煎煮２次后再将药液合并浓缩为含生药0.1g/mL。天麻钩藤饮加减方：天麻10g，钩藤20g，石决明30g，牡蛎30g，牛膝10g，均由中南大学湘雅医院中药房提供。石决明先煎20min，钩藤后下，煎煮２次后再将药液合并浓缩为含生药0.1g/mL。1.3主要试剂与仪器2DQuantKit蛋白质定量试剂盒、固相pH梯度干胶条（IPGstrippH310L，24cm）、IPGBuffer（PH310L）、覆盖液均由AmershanBioscie

3、nces公司提供；二硫苏糖醇（DTT）、丙烯酰胺、甘氨酸、苯甲基磺酸氟（PMSF）、3［（3胆酰胺丙基）二乙胺］丙磺酸（CHAPS）、十二烷基硫酸钠（SDS）、NNN′N′四甲基乙二胺（TEMED）、考马斯亮蓝、琼脂糖均由Sigma公司提供；低分子量标准蛋白质由上海伯奥生物制品公司提供；Trisbase为USB公司分装；碘乙酰胺购自Fluka公司。EttanIPGphorⅡ等电聚焦仪、EttanDALTⅡSystem垂直电泳槽（Amersham公司）；PDQuest7.0分析软件（BioRad公司）；Imagescanner扫描仪（Sigma公司）；

4、Elx800自动酶标仪（BilTekInstruments，Inc）；真空冷冻抽干仪（Ｓavant公司）；4307MALDITOFMS质谱仪（ABI公司）；二道生理记录仪（成都仪器厂）；清醒小动物血压测量器（中南大学湘雅医学院心脏生理研究室）。1.4分组与造模正常组SD大鼠10只；治疗组及模型组ＳＨＲ大鼠各１０只，完全随机（随机排列表法）分组。正常组大鼠连续灌服蒸馏水42d，于第43天处死。治疗组及模型组参照鄢东红等［4］的方法，连续灌服附子汤共21d，复制高血压肝阳上亢证模型；自第22天起模型组改为连续灌服蒸馏水21d，治疗组在同一时间灌服天麻钩藤饮加减方，均于

5、第43天处死。模型复制成功的标准参照鄢东红等［4］的方法，观察大鼠的外观及易激惹程度、饮水量、血压的变化（造模前，第3周末，第6周末）。血压测定采用杨绿化等［5］的尾动脉搏动法。各组动物腹腔注射水合氯醛麻醉，快速断头处死，冰上剥离下丘脑，装在标记好的冻存管后放在液氮中保存备用。1.5二维凝胶电泳（2DE）分离和分析1.5.1蛋白质双向电泳分离采用2DQuantKit蛋白质定量试剂盒的微量测试法测定总蛋白质浓度，蛋白质定量采用Bradford法［6］。蛋白质双向电泳参考IPGhorTM等电聚焦系统操作指南进行。参照文献［7］进行考马斯亮蓝染色。1.5.2凝胶图像分析采用

6、ImageScanner扫描仪及LabScan扫描软件进行扫描，获取图像。以PDQuest7.0分析软件进行图像分析。参照文献［8］，将蛋白质表达水平上升或下降200%的点选择为目标点进行鉴定。1.6差异蛋白质点的质谱分析和数据库检测1.6.1蛋白质的胶内酶解切取差异表达蛋白质斑点，经水洗、脱色处理后，参照FernandezJ等［9］的方法并加以改进进行蛋白质的胶内酶解和萃取，获得蛋白质肽混合样品。1.6.2基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDITOFMS）检测肽段样品采用MALDITOFMS检测，获得的混合物肽片段质量指纹图谱在SageScanner扫描后

7、，用PDQuest7.0分析软件可以检测到每组总蛋白质分布模式非常相似，且重复性好，每组约有700个左右的蛋白质斑点，以PI48和Mr200075000范围的蛋白质斑点分布最多。结果见图1。2.5各组差异表达蛋白与正常组比较，模型组图谱中有5个蛋白质斑点表达上升2倍及以上，且同一点在治疗组中表达下降2倍及以上，大致处于与正常组同一水平，有的点甚至较正常组低2倍或以上；有10个蛋白质斑点表达下降2倍及以上，且同一点在治疗组中表达上升2倍及以上，大致处于与正常组同一水平，有的点甚至较正常组高2倍或以上。结果见图2。2.6质谱结