人脐血间质干细胞一般特性及其多向分化潜能论文

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1、人脐血间质干细胞一般特性及其多向分化潜能论文王晶，李志忠，徐茅，迟作华【摘要】【目的】观察人脐血间质干细胞增殖能力、细胞表面分子标志及多向分化潜能。【方法】从人脐血中分离出单个核贴壁细胞并进行体外培养。将细胞以单克隆抗体标记后用流式细胞仪进行检测。向培养细胞中加入成骨、成软骨和成脂肪诱导剂，检测其多向分化能力。【结果】脐血间质干细胞原代培养时间为7周。流式细胞分析显示这些细胞CD29、CD13、CD44等表达为阳性，但是它们不表达造血干细胞表面标志物。加入成骨诱导剂会导致细胞碱性磷酸酶的表达。采用微球培养法并加入软骨诱导剂对细胞进行诱导，用阿尔新蓝染色显示有蛋白多

2、糖表达。在加入成脂诱导剂后，会导致细胞形态学改变.freelesenchymalstemcells,MSC）这一问题上，学者们却一直存在分歧。Erices等2的实验发现，从脐血分离的贴壁细胞表达间质干细胞相关抗原。而Mareschi等3研究却显示，从骨髓中容易分离出间质干细胞，而脐血中却不能。而且还有研究发现脐血中非造血干细胞表达内皮细胞4或树突状细胞的表面分子5。由此可见，对于脐血中非造血干细胞的定性方面，学术界仍无最终定论。本实验拟从脐血中分离并培养间质干细胞，对其一般生物学特性进行研究，同时对其进行成骨、成软骨以及成脂肪等诱导，观察其多向分化的潜能。1材料与

3、方法1.1主要试剂和仪器流式细胞仪(Coulter-Elite)，荧光标记小鼠抗人抗体：CD13-PE、CD106-PE、CD14-PE、CD45-PECY5、CD34-FITC、CD29-FITC、CD44-FITC、CD54-FITC、CD49f-FITC、HLA-DR-FITC（BDPharmingen），TGF-β1（PEPROTHCH）。1.2脐血间质干细胞的分离与培养1.2.1羟乙基淀粉沉淀法分离脐血间质干细胞无菌条件下采集孕33～41周顺产或剖宫产胎儿脐血50～80mL，肝素抗凝。孕妇无传染性疾病，胎儿无畸形，并征得家属及孕妇同意。将脐血与6%的羟乙

4、基淀粉4∶1比例混匀，室温静置60min，待红细胞与血清分界清楚，吸取上清以400×g离心5min，弃上清，有核细胞沉淀于管底，PBS洗涤2次。1.2.2脐血间质干细胞的原代及传代培养将DMEM/F12+10%胎牛血清加入离心管中，吹打制成单细胞悬液。以5×106/cm2密度接种于T25培养瓶中，置于37℃、饱和湿度，体积分数为5%CO2孵箱中培养。5d首次全量换液，去掉未贴壁的悬浮细胞。以后每周换液1次，待细胞长到80%汇合时，按照1∶2的比例传代。传代后每周换液2次，细胞汇合达80%时继续按1∶2比例传代培养。1.3细胞表面标记物检测将第3代细胞以0.25%胰

5、酶消化后，PBS洗涤3次，制成1×106/mL的细胞悬液。将待检细胞样品分为每管0.1mL，阴性对照管加入鼠IgG-FITC、IgG-PE或IgG-PECY5，其它管分别加入鼠抗人CD13-FITC、CD106-FITC、CD14-FITC、CD45-PECY5、HLA-DR-FITC、CD34-FITC、CD29-FITC、CD44-FITC、CD54-FITC、CD49f-FITC各20μL，室温孵育30min，流式细胞仪计数5000～10000个细胞，仪器自带软件分析。1.4细胞周期测定取第3代细胞，用0.25%胰酶室温消化，PBS洗涤3次，弃上清。向离心管

6、中加入1mL预冷的70%的酒精，充分吹打制成单细胞悬液，细胞浓度约为1×106/mL。于4℃冰箱中固定24h后，离心，去上清，沉淀物重悬在1mL碘化丙啶染液中（含RNaseA10μg/mL，碘化丙啶50μg/mL），4℃孵育20min。上流式细胞仪检测分析细胞周期。1.5脐血间质干细胞向成骨细胞诱导成骨细胞诱导培养基：DMEM/F12，10%FBS，10－8mol/L地塞米松，l0mmol/L?茁-磷酸甘油和50mg/L抗坏血酸。取第3代细胞，以5×103/cm2密度接种于预置盖玻片的6孔板内。用成骨培养基诱导21d取出盖玻片进行碱性磷酸酶染色（钙-钴法）。1.6

7、脐血间质干细胞向软骨细胞诱导软骨细胞诱导培养基：高糖DMEM，1％FBS，胰岛素6.25μg/mL，维生素C50μg/mL，地塞米松10-8mol/L，10ng/mgTGF-β1。将2.5×105/mL细胞加入15mL离心管内，150×g离心15min，使细胞成微团。加入软骨诱导培养基，于37℃，5%CO2孵箱内培养，每2d换液。分别于第1、2、3周将细胞微团取出，用4％多聚甲醛固定。脱水，石蜡包埋，行5μm切片，Alcianblue染色。1.7脐血间质干细胞向脂肪细胞诱导脂肪细胞诱导培养基：DMEM/F12，10%FBS，1?滋mol/L地塞米松，5U/mL胰岛

8、素。取第3