犬脐血间质干细胞的肌源性分化

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1、上海第二医科大学硕士学位论文犬脐血间质干细胞的肌源性分化姓名：罗凯申请学位级别：硕士专业：外科学（心胸外）指导教师：单根法2003.1.1脐血间质干细胞的肌源性分化中文详细摘要目的建立一套脐血间质干细胞在体外条件下的采集、分离、传代、扩增的比较成熟和稳定的方法；了解脐血间质干细胞表面抗原的表达；观察脐血间质干细胞在一定诱导条件下向肌源性细胞的分化能力。方法选取不同孕龄的妊娠杂种犬，按照正规的动物试验操作，在无菌条件下采集犬脐带血，离心后接种于37。C、5％C02的细胞培养环境中，分别选择IMDM、a-MEM、DMEM和EBM．II等四种不同的基础培

2、养基，在相同的条件下观察脐血细胞在不同的培养基中的生长增殖情况；选择不同浓度的胰酶+EDTA(O．25％--0．06％)对生长至70％---80％融合的脐血间质干细胞进行消化传代处理；选择生长至50％--60％融合的脐血贴壁细胞，采用间接法，检测脐血细胞CDlla、CDIlb、CD29、CD34和CD71等一系列表面抗原的表达；分别选择第二代、第四代和第六代的脐血间质干细胞作为肌源性诱导分化的对象，不同浓度的5-azacytidine(5umol／L、10umol／L、20umol／L)作为诱导分化剂，作用24小时，分别于第一周、第二周和第三周在镜

3、下观察脐血细胞形态结构的动态改变，同时检测经5．aza处理后的脐血间质干细胞a-actin、desmin和myosinheavychain(MHC)等肌源性特异性标记物的表达，并以成年杂种犬的颈部、肋间部骨骼肌和心肌组织作为其阳性对照。结果共采集11例不同孕龄、胎数和体重的妊娠杂种犬脐带血，犬的孕龄越长、胎数越多，脐血间质干细胞的数量和质量相对越低。脐血间质干细胞在IMDM和a-MEM混合细胞培养液中生长良好，细胞形态正常，生长增殖迅速，而在DMEM、和EBM—II等其他混合细胞培养液中生长增殖不甚理想，细胞形态不规则，增殖缓慢：脐血细胞在培养过程

4、中可观察到两类不同的细胞，一类为典型的纤维母细胞样细胞，梭形或纺锤形，细胞增殖迅速，一类为破骨细胞样细胞，圆形或椭圆形，细胞体积巨大，核大，呈分叶状，细胞增殖缓慢。脐血间质干细胞在0．125％和0．06％的消化酶作用下可传至7．8代，每传一代细上海第二医科大学硬士研究生毕业论文一3一中文详细摘要胞可增殖约2．3倍，细胞在第五代前可保持稳定的形态和增殖能力，而在5代之后细胞逐渐出现老化趋势，细胞内颗粒状物质增多，增殖能力下降。脐血间质干细胞表达CD29，CD71，不表达CDlla，CDllb和CD34。第二代和第四代的脐血间质干细胞在10umol／L

5、的5-aza作用后形态逐渐发生改变，细胞体积延长，形成伪足样胞浆突起，并与l临近细胞建立连接；5-aza处理后的脐血间质干细胞表达a-actin和desmin，不表达MHC，阳性对照组中，犬颈部、肋间部骨骼肌和心肌表达a．actin，desmin，同样不表达MHC。结论犬脐血贴壁细胞中包含两类不同的细胞，其中间质干细胞是一类不同于造血干细胞的处于原始未分化状态的干／祖细胞，间质干细胞的数量和质量与妊娠犬的孕龄和胎数等因素存在一定关系：脐血间质干细胞在诱导分化剂的作用下可向肌源性细胞定向分化，为干细胞心肌移植的治疗提供了新的细胞材料来源和思路。关键词

6、脐血；间质干细胞；5-azacytidine；心肌再生-4-英文摘要Themyo-differentiationofMesenchymalStemCellsinUmbilicalCordBioodAbstractobjecfiveToestablishamorestableandsuccessfulprocessofcollection、culture、passageandproliferationinvitroofmesenchymalstemcells(MSC)derivedfromcanineumbilicalcordblood(UCB)；t

7、ostudytheexpressionofaseriesofantigenofcordblood-derivedMSCandthedifferentiationofMSCfromcordbloodintothemyocyteundercertaincircumstance．MethodsUmbilicalcordbloodsampleswerecollected，accordingtotheroutineprocedure，from1lpregnanthybridcanineswhichwereatdifferentgestationalagebe

8、tween40daysand50days．Aftercentrifugatedandwashed，themononucle