缬沙坦对单侧输尿管梗阻模型大鼠肾间质纤维化作用

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1、缬沙坦对单侧输尿管梗阻模型大鼠肾间质纤维化作用：王凯孙建平刘丽秋马瑞霞李玉山周立冬【摘要】目的研究血管紧张素Ⅱ型受体拮抗剂缬沙坦对单侧输尿管梗阻(UUO)模型大鼠肾间质纤维化进程的作用。方法健康ethodsAUUOmodelin)的合成与降解失衡，导致ECM在肾间质的广泛沉积是肾间质纤维化发生的本质[2]。肾间质纤维化的促进因素涉及范围较广,转化生长因子β1(TGFβ1)是目前公认的强致纤维化因子[4]。骨桥蛋白(OPN)存在于多种生物中，可以多种不同的成熟形式存在于不同的组织细胞及正常体液中，具有多种生物学效应，可以引起大量炎性细胞浸润，而炎性细胞可产生TGFβ1，参

2、与间质成纤维细胞和肾小管上皮细胞ECM的过量合成,最终导致肾间质纤维化的发生。本实验选用TGFβ1、OPN作为观察指标，探讨缬沙坦抗肾间质纤维化的作用机制，为临床应用提供实验依据。　　1材料与方法　　1.1动物模型的建立与分组　　50只雄性ARK公司生产全自动生化仪(型号AGⅡ)分别测定血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平。　　1.2.2肾脏组织病理学观察石蜡包埋组织切片，片厚2μm，行常规苏木精伊红染色，在200倍光镜下观察肾小管间质病变情况。　　1.2.3OPN检测采用EliVision法，抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，免疫组化检测试剂盒购自福州迈新生物工程

3、有限公司，切片厚度2μm，一抗为兔抗大鼠多克隆抗体(1∶100)，二抗为羊抗兔IgG(1∶100),DAB显色，并以0.01mmol/LPBS缓冲液作为空白对照。采用ImageProPlus病理图像分析软件，每张切片随机采集10个视野，检测阳性目标累积吸光度、空白区域面积，计算切片平均吸光度，用其反映OPN的表达强度。　　1.2.4TGFβ1mRNA表达检测采用RTPCR方法，以SimplyP总RNA提取试剂盒(杭州博日生物科技有限公司)提取总RNA,严格按照其说明书操作。在核酸蛋白测定仪(德国Eppendorf)上测定总RNA的吸光度(A)值并计算其浓度。RT及PCR

4、操作步骤按照试剂盒说明书进行(日本TAKARA公司)。TGFβ1引物：正义链5′GCCTGAGTGGCTGTCTTTTGA3′,反义链5′GGAAGGGTCGGTTCATGTCAT3′,扩增产物长度为197bp。GAPDH引物：正义链5′GCAAAGTGGAGATTGTTGCCAT3′,反义链5′CCTTGACTGTGCCGTTGAATTT3′,扩增产物长度为108bp。TGFβ1的扩增条件为：94℃2min，94℃30s，58℃30s，72℃1min，共32个循环;GAPDH的扩增条件为：94℃2min，94℃30s，58℃30s，72℃1mi

5、n，共30个循环;最后均72℃终末延伸10min。取上述扩增产物5μL在含溴化乙锭(0.5mg/L)的20g/L的琼脂糖凝胶上电泳，紫外线透射凝胶成像仪(法国VilberLourmat公司)检查有无特异条带并扫描各电泳带的灰度值，用美国BioRad公司的MolecularAnalyst软件进行半定量分析，计算其与内参照GAPDH吸光度比值。　　1.3统计学处理　　以SPSS10.0统计软件进行数据处理，计量资料结果以±s表示，对所测结果进行正态性及方差齐性检验。均数的多组间比较采用方差分析。　　2结果　　2.1各组大鼠术后不同时间生化指标的比较　　与对照组比较，模型组

6、及缬沙坦组大鼠术后第3天Scr及BUN差异无显著性(P>0.05)，第10、20天时显著增高,差异有统计学意义(F=11.75～40.83，q=3.32～11.87,P<0.05)。与模型组相比，缬沙坦组Scr及BUN术后第10、20天均较低，差异有显著性(q=3.36～9.55，P<0.05、0.01)。见表1、2。　　2.2术后大鼠肾脏组织病理学的改变　　光镜下观察，术后第3天，模型组大鼠肾小管上皮细胞呈灶状空泡和颗粒变性，肾间质偶见灶状淋巴和单核细胞浸润，肾小管上皮细胞除变性外，部分出现崩解脱落及再生，部分呈灶状上皮细胞萎缩，管腔扩张，萎缩小管周围出现

7、纤维化，伴少量淋巴和单核细胞浸润;第20天后肾间质纤维化及肾小管萎缩加重，呈多灶分布。肾小球始终无明显变化。各时间点治疗组与模型组相比，未见明显形态学差异。对照组大鼠肾脏无形态学异常。　　2.3各组大鼠术后不同时间肾组织OPN表达的比较　　对照组肾组织中OPN主要表达于部分肾小管近曲小管、远曲小管、髓袢升支粗段及一些集合管上，肾间质未见着色;与对照组相比，模型组及缬沙坦组大鼠自第3天起OPN在肾小管间质的阳性染色强度明显升高，差异有显著意义(F=64.36～231.51，q=14.17～30.42,P&