生物化学实验指导书

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1、《生物化学实验》指导书西安工程大学生物工程系二〇一一年十一月二十五日21目录实验1蛋白质的沉淀,变性反应3实验2蛋白质含量的测定7实验3氨基酸的分离鉴定—薄层层析法9实验4液化淀粉酶活力测定11实验53,5-二硝基水杨酸比色定糖法14实验6核酸浓度测定—紫外线（UV）吸收法16实验7血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳18实验8植物中抗坏血酸含量的测定2021实验1蛋白质的沉淀,变性反应目的要求：了解蛋白质的沉淀反应,变性作用和凝固作用的原理及它们的相互关系。原理：在水溶液中，蛋白质分子的表面，由于形成水化层和双电层而形成稳定的胶体颗粒，所以蛋白质溶液和其他亲水胶体溶

2、液相类似。但是，蛋白质胶体颗粒的稳定性是有条件的，相对的。在一定物理化学因素影响下，蛋白质颗粒失去电荷，脱水，甚至变性，则以固态形式从溶液中析出，这个过程称为蛋白质的沉淀反应，这种反应可以分为以下两种类型。一、可逆沉淀反应在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但它的分子结构并未发生显著的变化，基本上保持原有的性质，沉淀因素除去以后，能再溶于原来的溶剂中。这种作用称为可逆沉淀反应，又叫做不变性沉淀反应，属于这一类的反应有盐析作用；在低温下，乙醇，丙酮对蛋白质的短时间作用以及利用等电点的沉淀等。二、不可逆沉淀反应在发生沉淀反应时，蛋白质分子结构，空间构象遭到破坏

3、，失去原来的天然性质，这时蛋白质已发生变性。这种变性蛋白质的沉淀不能再溶于原来溶剂中的作用叫做不可逆沉淀反应。重金属盐，植物碱试剂，过酸，加热，震荡，超声波，有机溶剂等都能够使蛋白质发生不可逆沉淀反应。实验操作一、试剂1．蛋白质溶液取5mL鸡或鸭蛋清，用蒸馏水稀释至100mL，搅拌均匀后用4—8层纱布过滤，新鲜配制。2．蛋白质氯化钠溶液21取20mL蛋清，加蒸馏水200mL和饱和氯化钠溶液100mL，充分混匀后，以纱布过滤不溶物（加入氯化钠的目的是溶解球蛋白）。饱和硫酸铵溶液，3%硝酸银，0.5%乙酸铅，浓盐酸，浓硫酸，浓硝酸，5%磺基水杨酸，0.1%硫酸铜

4、，饱和硫酸铜溶液，0.1%乙酸，10%乙酸，饱和氯化钠溶液，10%氢氧化钠溶液。二、器材试管，试管架，滤纸，滴管。三、操作1、蛋白质的可逆沉淀反应——蛋白质的盐析作用用大量中性盐使蛋白质从溶液中沉淀析出的过程称为蛋白质的盐析作用。蛋白质是亲水胶体，在高浓度的中性盐影响下，蛋白质分子被盐脱去水化层，同时蛋白质分子所带的电荷被中和，结果蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。析出的蛋白质仍然保持其天然蛋白质的性质，减低盐浓度时，还能溶解。沉淀不同的蛋白质所需中性盐的浓度不同，而盐类不同也有差异。例如：向含有清蛋白和球蛋白的鸡蛋清溶液中加入硫酸镁或氯化钠至饱和，则球

5、蛋白沉淀析出。加硫酸铵至饱和，则清蛋白析出。另外，在等电点时，清蛋白可被饱和硫酸镁或氯化钠或半饱和的硫酸铵溶液沉淀析出。所以在不同条件下，用不同浓度的盐类可将各种蛋白质从混合溶液中分别沉淀析出，该法称为蛋白质的分级盐析。目前在酶的生产和制备，科研工作和临床化验等工作中广泛应用。取一支试管加入3mL蛋白质氯化钠溶液和3mL饱和硫酸铵溶液，混匀，静置约10min，球蛋白则沉淀析出。2、蛋白质的不可逆沉淀反应（1）金属沉淀反应21重金属盐类易与蛋白质结合成稳定的沉淀而析出。蛋白质在水溶液中是酸碱两性电解质，在碱性溶液中（对蛋白质的等电点而言），蛋白质分子带负电荷，

6、能与带正电荷的金属离子结合成蛋白质盐。在有机体内，蛋白质常以其可溶性的钠盐或钾盐的形式存在，当加入汞，铅，铜，银等重金属盐时，则蛋白质形成不溶性的盐类而沉淀。经过这种处理后的蛋白质沉淀不再溶解于水中，说明它已经发生变性。重金属盐类沉淀蛋白质的反应通常很完全，特别是在碱金属盐类存在时。因此，生化分析中，常用重金属盐除去体液中的蛋白质；临床上的蛋白质解除重金属盐的食物性中毒。但应注意，使用乙酸铅或硫酸铜沉淀蛋白质时，试剂不可加过量，否则可以使沉淀出的蛋白质重新溶解。取3支试管，各加入约1mL蛋白质溶液，分别加入3%硝酸银3—4滴，0.5%乙酸铅1—3滴和0.1%

7、硫酸铜3—4滴，观察沉淀的生成。向第二，三支试管再分别加入过量的乙酸铅和饱和硫酸铜溶液，观察沉淀的再溶解。a有机酸沉淀蛋白质有机酸能使蛋白质沉淀。磺基水杨酸最有效，能将血清等生物体液中的蛋白质完全除去，因此得到广泛应用。B无机酸沉淀蛋白质浓无机酸（除磷酸外）都能使蛋白质发生不可逆的沉淀反应。这种沉淀作用可能是蛋白质颗粒脱水的结果。过量的无机酸（硝酸除外）可使沉淀出的蛋白质重新溶解。临床诊断上，常利用硝酸沉淀蛋白质的反应，检查尿中的蛋白质的存在。取三支试管，分别加入浓盐酸15滴，浓硫酸，浓硝酸10滴。小心地向三支试管中，沿管壁加入蛋白质溶液6滴，不要摇动，观察

8、各试管内两液面处有白色环状蛋白质沉淀出现。然后摇动每