食品专业基础实验指导书-生物化学实验

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1、《食品质量与安全》专业基础实验指导书上海理工大学医疗器械与食品学院实验实训中心10目录课程名称：《生物化学实验指导》实验名称：实验一蛋白质含量的测定－考马斯亮蓝G250染色法实验二蛋白质的两性性质及等电点的测定实验三紫外吸收法测定核酸的含量实验四可溶性总糖的测定（蒽酮比色法）10实验一蛋白质含量的测定－考马斯亮蓝G250染色法一、实验目的：通过实验掌握蛋白质的定量测定方法。二、预习要求：要求预习实验讲义。三、实验原理：考马斯亮蓝G250测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。考马斯亮蓝G

2、-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。蛋白质和考马斯亮蓝G-250结合，在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1小时内保持稳定。蛋白质-染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，可测微克级蛋白质含量。四、实验设备与器材：仪器721型分光光度计、分析天平（万分之一）、量筒（100ml）、烧杯(250ml)、移液管(1ml,5m

3、l)、漏斗、漏斗架、容量瓶(100mL,1000mL)、试管试剂：牛血清白蛋白蛋白质标准溶液：称取10mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为100μg/mL的蛋白溶液。考马斯亮蓝G250试剂：称取100mg考马斯亮蓝G250溶于50mL90%乙醇溶液中，加入85％的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容至1000mL。此溶液在室温下可放置1个月。1095％乙醇溶液85％磷酸一、实验内容与步骤：1、标准曲线绘制取6支试管，按下表加入各试剂。管号012345100μg/ml蛋白标准液／mL00.20.40.60.81.0蒸馏水／mL1.00.80.60.40.20考马斯亮蓝液／mL5.05.0

4、5.05.05.05.0加入考马斯亮蓝G-250蛋白试剂后，摇匀，放置2min后，在595nm波长下比色测定，记录A595。以各管相应标准蛋白质含量（mg）为横坐标、A595为纵坐标，绘制标准曲线。2、样品提取液中蛋白质浓度的测定吸取待测蛋白样液0.5mL放入试管中，加入蒸馏水0.5mL混匀后，再加入5.0mL考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀，放置5min后，在595nm波长下比色，记录A595。根据所测A595从标准曲线上查得蛋白质含量，以蒸馏水作空白样。3、结果计算样品中蛋白质含量（μg/g鲜重）＝C×离心后的体积（mL）/样品鲜重（g）式中C为在标准曲线上查得的蛋白质浓度（μg/mL）【

5、注意事项】 （1）如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5～20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。比色反应需在1h内完成。（2）测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。二、思考题：1.除了考马斯亮蓝G250法测定蛋白质含量外，还学过哪些方法可测定蛋白质含量，这些方法各有何优缺点？10实验二蛋白质的两性性质及等电点的测定一、实验目的：（1）通过实验了解蛋白质的两性性质及等电点与蛋白质分子聚沉的关系。（2）掌握通过聚沉测定蛋白质等电点的方法。二、预习要求：要求预习实验讲义。三、实验原理：蛋白

6、质是两性电解质。蛋白质分子中可以解离的基团除N－端α－氨基与C－端α－羧基外，还有肽链上某些氨基酸残基的侧链基团，如酚基、巯基、胍基、咪唑基等集团，他们都能解离为带电基团。因此，在蛋白质溶液中存在着下列平衡：阳离子两性离子阴离子pHpI电场中：移向阴极不移动移向阳极调节溶液的pH使蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等，即所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点。在等电点时，蛋白质溶解度最小，溶液的混浊度最大，配制不同pH的缓冲液，观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情况即可确定蛋白质的等电点。四、实验设备与器材：仪器：试管架，试管：15ml×6，刻度吸管

7、：1ml×4，2ml×4，10ml×2，胶头吸管×2试剂：1、1mol/L乙酸：吸取99.5%乙酸（比重1.05）2.875ml，加水至50ml。2、0.1mol/L乙酸：吸取1mol/L乙酸5ml，加水至50ml。3、0.01mol/L乙酸：吸取0.1mol/L乙酸5ml，加水至50ml。4、0.2mol/LNaOH：称取NaOH2.000g，加水至50ml，配成1mol/LNaOH。然后量取1mol/LN