经静脉移植骨髓间质干细胞治疗脑梗死论文

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　　经静脉移植骨髓间质干细胞治疗脑梗死论文张志坚,王伟,陈施艳,吴秀丽,苏津自,刘春风【关键词】,间质干细胞移植;,脑梗死;,疾病模型,动物摘要:目的观察经静脉移植骨髓间质干细胞(MSC)治疗脑梗死时神经功能缺损的恢复情况,以及MSC在脑梗死灶的分布、迁移与分化情况。方法经尾静脉将标记的大鼠骨髓间质干细胞(rMSC)或磷酸缓冲液(PBS)植入脑梗死鼠体内,于不同时程对动物神经功能状况进行评分。应用荧光标记及免疫组织化学方法检测移植细胞在脑内存活、迁移及分化情况，细胞化学染色观察rMSC体外分化情况。结果与PBS组相比,rMSC组大鼠神经功能改善明显(P0.001),.freelinimumessentialmedium,AlphaModified,美国Gibco公司);胎牛血清(FBS,美国Hyclone公司);FicollPaque淋巴细胞分离液(美国Pharmacia公司);0.25%胰蛋白酶(Trypsin1∶250,美国Amersco公司);荧光染料(celltrackerorange,CTO,美国Invitrogen公司);小鼠抗大鼠巢蛋白(Nestin)多克隆抗体、小鼠抗大鼠神经丝蛋白(NF200)多克隆抗体及兔抗大鼠神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)多克隆抗体(武汉BOSTER公司);SABCFITC免疫组织化学试剂盒(武汉BOSTER公司),PV6001/2试剂盒(北京中山试剂公司)。1.2方法1.2.1大鼠骨髓间质干细胞(ratmesenchymalstemcells,rMSC)的分离、扩增、保存、表面标志抗原鉴定与标记参照文献7。大鼠腹腔注射45mg/100g戊巴比妥钠麻醉。取骨髓加于FicollPaque淋巴细胞分离液上离心,吸取中间单核细胞层,洗涤,调整细胞密度后按1.6×104cm-2接种于培养瓶。培养液含15%FBS、青霉素100U/mL,链霉素100mg/L。置37℃、体积分数为0.05的CO2、饱和湿度的孵箱内培养。在每次培养传代时部分分装冻存,部分继续传代,传至第5代。1.2.1.1细胞冻存将消化下的细胞悬液离心,调整浓度为(1~3)×106mL-1,分装于1mL的冻存管,置4℃40~60min后,再置-20℃2h,于-80℃冰箱过夜,最后置液氮中。复苏细胞时将冻存管迅速放入37℃温水中融化,加培养液3mL混悬,离心,弃上清,加入含20%FBSαMEM培养液,接种于培养瓶中培养。1.2.1.2流式细胞术检测调整第4代rMSC细胞浓度为(1~3)×106mL-1,分装6管,每管100μL,每2管1组。分别加入CD34PE与CD45FITC抗体。于4℃避光孵育30min后检测。1.2.1.3荧光染料CTO标记rMSC参照文献8。将10mmol/L CTO二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)贮存液配制成1μmol/L标记液。当rMSC长满瓶底时加入标记液5mL,37℃孵育45min,吸掉标记液,加入无血清培养基5mL,37℃孵育30min,于荧光显微镜下观察细胞均发出红色荧光。1.2.2线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型参照文献9方法并改进。大鼠2%戊巴比妥钠(45mg/kg)腹腔麻醉,仰卧固定于手术台,分离左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA),结扎并游离ECA及其分支,沿ICA向下分离翼腭动脉(PPA),用线将其悬吊。夹闭CCA和ICA,于ECA残端起始部剪一小口,由此口轻轻插入直径0.23mm末端成球状的尼龙线,至大脑中动脉(MCA)起始部。在ECA处结扎线的末端,去除悬吊线,松开夹闭CCA的动脉夹。尼龙线插入深度从CCA分叉处开始计算约(18±1.5)mm。MCA血流阻断2h后再次麻醉,重新暴露切口,缓慢抽出尼龙线使其球端回到ECA内,即恢复MCA血供,实现再灌注。1.2.3分组与移植将模型鼠32只随机分为4组,每组8只,分别于再灌注后24h经尾静脉移植:PBS1mL作为对照组（分为A、B组),rMSC悬液1mL作为移植组(分为C、D组)。其中A、C组于1周后取脑,B、D组于2周后取脑。各组于术后24h、移植后1周、2周按mNSS评分法进行神经功能评分10,评分者不知道动物分组情况。1.2.4免疫化学染色及荧光观察取脑包埋后作5μm厚连续切片,每隔5片取1片直接于荧光显微镜下观察标记细胞在脑内的分布,其余切片进行免疫组织化学染色。切片封闭后分别加抗Nestin、NF200及GFAP一抗,4℃孵育过夜;再加生物素标记二抗,最后滴加SABCFITC,封固后分别于不同波长的激发光下观察CTO及FITC阳性细胞在脑内的分布。移植后D组于相同的部位每隔5张取1张切片,连取5张,分别计数梗死区及其周边区域CTO阳性细胞数,以及阳性细胞中Nestin、NF200、GFAP阳性细胞率。同时将体外继续培养的rMSC爬片固定后按PV6001/2试剂盒方法分别加入上述抗体,4℃孵育过夜,最后行DAB染色及苏木精对比染色,显微镜下观察rMSC体外分化表达情况。1.3统计学处理对各组不同时间点的mNSS评分用SPSS11.0软件行独立样本t检验。取α=0.05。2结果2.1rMSC的培养与流式细胞术鉴定rMSC接种24h后大部分细胞贴壁且形态不一,成梭形的成纤维细胞样或多角形改变,核较大,位于细胞中央或边缘。细胞以分散的克隆集落方式增殖,10d左右每个集落约含有100~200个细胞,细胞形态基本为纺锤型。12~14 d融合成单层。传代细胞24h内完全贴壁,6h细胞达到完全融合,成均匀一致的纺锤形。rMSC体外扩增5代细胞数约为(1~2)×1011。第4代rMSC经流式细胞术检测,CD34阳性率为2.19%,CD45阳性率为0.19%。2.2行为学评分MCAO后24h各组mNSS评分差别无统计学意义(P0.05)。移植后1~2周大鼠运动和平衡功能有不同程度恢复。C、D组在第1周时功能恢复明显,D组在第2周仍有不同程度恢复;A、B组的神经功能恢复相对较慢。A、B组在1、2周时评分均低于C、D组,差别有统计学意义(P0.001)。2.3免疫化学染色及荧光观察rMSC经CTO标记后大部分细胞发出红色荧光,细胞标记率达100%(图1)。脑切片直接于545~580nm波长的激发光下观察,A、B组中未见到发出红色荧光的细胞;C、D组均可见CTO标记的细胞发出红色荧光,主要在缺血区;第2周时标记细胞存活数有所下降,但更为集中地分布在缺血梗死区(图2),其他脑区罕见。免疫组织化学见有些CTO标记的rMSC能够分化表达神经细胞Nestin、NF200及GFAP等标志物(图3),同时rMSC在体外培养2周后细胞化学染色未见表达神经细胞标志物。移植后D组在相同的部位各计数5张切片上梗死灶及其周边区域CTO平均阳性细胞数为(185±30)个,这些阳性细胞中Nestin、NF200、GFAP阳性细胞率分别占3.2%,2.7%及8.1%。图1CTO标记的大鼠骨髓间质干细胞(红色×200)（略）Fig1rMSClabeledicfocus(×200)A:Nestin;B:NF200;C:GFAP.上排:CTO标记的植入细胞(红色荧光,→);下排:与上排同一切片植入细胞免疫荧光组织化学染色(绿色荧光,→).图3D组脑梗死区CTO标记阳性细胞分化表达神经细胞标志物(×200)（略）Fig3SomeCTOlabeledcellsincerebralischemicfocusofgroupDexpressthemarkersofnervecells(×200)3讨论3.1MSC脑移植治疗脑梗死研究的概况 近年研究发现胚胎干细胞或MSC移植入脑后可分化表达神经细胞标志物,对脑损伤后的神经功能恢复有促进的作用16,这种作用为很多学者重视。因为长期以来,对脑损伤,特别是脑梗死后的神经功能缺损的治疗一直都没有较好的方法。因此与此相关的研究,如在脑梗死动物模型上的干细胞移植实验,就成为探讨干细胞在中枢神经系统行为的重要手段。在干细胞移植治疗脑梗死的实验研究中,选用MSC进行移植很受重视,MSC的优点为:具有强大增殖能力;易于从骨髓中获取;应用较少受伦理的制约;体外分离扩增MSC的方法较成熟;将来在临床上可以应用患者自身的MSC进行移植治疗,从而避免免疫排斥。同时,在MSC的移植方法上也力求接近临床实际。国内外有不少研究者采用脑立体定位注射的方法移植MSC,该方法会对脑组织造成创伤,在临床上病人也不乐意接受,同时植入的细胞分布不均匀。因此应用静脉路移植MSC来治疗脑梗死的探讨无疑是有意义的。3.2选用MSC脑移植治疗脑梗死的疗效观察骨髓中的干细胞分为造血类干细胞与MSC两大类,MSC无特异性的表面标志。根据MSC培养时的贴壁生长特性,以及笔者前期实验中rMSC表面标志的鉴定显示CD34、CD45表达率接近于零,由此表明所分离的细胞不是造血类干细胞,从而间接认定其为MSC7。Li等将一定数量MSC注射到小鼠脑缺血侧纹状体,观察到大量MSC在损伤局部聚集,部分移植细胞分别表达GFAP和神经元特异性核蛋白(NeuN),并且移植组的神经功能恢复明显好于对照组1。Chen等经静脉将MSC移植到MCAO后的鼠体内,得出类似结果2。本研究结果与前人基本一致,rMSC组的神经功能恢复明显好于PBS组,免疫荧光双标染色显示CTO阳性细胞在脑内主要存活、迁移、聚集在损伤区,且小部分分化表达Nestin、NF200及GFAP,而与之相对照的细胞化学染色并未发现体外培养的rMSC能表达神经细胞标志物,说明在动物模型体内的微环境作用下rMSC能分化表达神经元和神经胶质细胞标志物。3.3经静脉路移植rMSC治疗脑梗死的优点经静脉路移植rMSC不仅避免了立体定位注射的脑组织损伤,更可贵的在于植入细胞在病灶的均匀分布,而不是在立体定位注射时见到的大多分布在注射针孔附近,由此不可否认rMSC在植入体内后经历了向病灶趋化聚集的过程,损伤部位的血脑屏障并没有对这种趋化造成阻碍。对这一现象的解释是可能脑组织损伤后释放一些细胞黏附和趋化因子,与干细胞的有关受体相互作用,从而对rMSC产生一定的趋化性1112;同时脑梗死后血脑屏障的破坏,有助于静脉移植的rMSC进入缺血脑区。rMSC的这种病灶趋化性对移植治疗一些急性组织损伤具有很大的意义。 采用经静脉路移植rMSC的方法治疗大鼠脑梗死不仅取得了与脑立体定位注射所具有的治疗效果,同时避免了脑组织损伤,优化了植入细胞在病灶的分布。关于rMSC对脑梗死的治疗效果,其机制尚未完全明了,到底是移植细胞向病变部位组织渗透、融合而替代或补充损伤的神经细胞,还是仅分泌一些细胞因子和营养因子起作用1317,这些需要更加深入地研究。移植的rMSC向病灶的趋化现象也很有研究价值,对其趋化机制的研究不仅有益于对移植细胞的迁移调控,同时也提示MSC可以作为治疗基因的载体,把治疗基因带到最需要的病灶部位。