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1、经静脉移植骨髓间质干细胞治疗脑梗死张志坚,王伟,陈施艳,吴秀丽,苏津自,刘春风【关键词】,间质干细胞移植;,脑梗死;,疾病模型,动物 摘要:目的观察经静脉移植骨髓间质干细胞(MSC)治疗脑梗死时神经功能缺损的恢复情况,以及MSC在脑梗死灶的分布、迁移与分化情况。方法经尾静脉将标记的大鼠骨髓间质干细胞(rMSC)或磷酸缓冲液(PBS)植入脑梗死鼠体内,于不同时程对动物神经功能状况进行评分。应用荧光标记及免疫组织化学方法检测移植细胞在脑内存活、迁移及分化情况，细胞化学染色观察rMSC体外分化情况。结果与PBS组相比,rMSC组大鼠神经功能改善明显(P0.001),在显
2、微镜下可见脑移植细胞在梗死区及其周边区聚集并存活,有部分植入细胞分化表达神经细胞表面标志物,而在体外同时程培养的rMSC未见类似分化表达。结论rMSC经静脉移植后能够在宿主脑内存活、迁移并分化表达神经细胞表型,有促进脑梗死后神经功能恢复的作用。经静脉路移植可以避免脑组织损伤,同时植入的rMSC能更均匀分布并聚集在脑梗死灶。 关键词:间质干细胞移植;脑梗死;疾病模型,动物 研究发现，骨髓间质干细胞(MSC)在体内外特定条件的诱导下可以分化表达神经细胞标志物,MSC脑移植对急性缺血性神经损伤的功能恢复有一定治疗作用[13]。在脑梗死的干细胞移植治疗过程中,如何移植干
3、细胞到需要的病灶部位而又不对神经组织造成机械损伤,这个问题在国内的类似研究中显得较为突出,如采用脑立体定向注射的方法,本身就对脑组织结构造成损伤,而且植入细胞的分布不均匀[46]。笔者从静脉路移植MSC,观察MSC在脑梗死灶的分布、迁移与分化情况。 1材料与方法 1.1材料清洁级雄性SD大鼠,2~3月龄,体质量280~320g[福建医科大学实验动物中心,实验动物质量许可证号:SGXK(闽)20040002]。αMEM培养液(minimumessentialmedium,AlphaModified,美国Gibco公司);胎牛血清(FBS,美国Hyclone公司);
4、FicollPaque淋巴细胞分离液(美国Pharmacia公司);0.25%胰蛋白酶(Trypsin1∶250,美国Amersco公司);荧光染料(celltrackerorange,CTO,美国Invitrogen公司);小鼠抗大鼠巢蛋白(Nestin)多克隆抗体、小鼠抗大鼠神经丝蛋白(NF200)多克隆抗体及兔抗大鼠神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)多克隆抗体(武汉BOSTER公司);SABCFITC免疫组织化学试剂盒(武汉BOSTER公司),PV6001/2试剂盒(北京中山试剂公司)。 1.2方法 1.2.1大鼠骨髓间质干细胞(ratmesenchymal
5、stemcells,rMSC)的分离、扩增、保存、表面标志抗原鉴定与标记参照文献[7]。大鼠腹腔注射45mg/100g戊巴比妥钠麻醉。取骨髓加于FicollPaque淋巴细胞分离液上离心,吸取中间单核细胞层,洗涤,调整细胞密度后按1.6×104cm-2接种于培养瓶。培养液含15%FBS、青霉素100U/mL,链霉素100mg/L。置37℃、体积分数为0.05的CO2、饱和湿度的孵箱内培养。在每次培养传代时部分分装冻存,部分继续传代,传至第5代。 1.2.1.1细胞冻存将消化下的细胞悬液离心,调整浓度为(1~3)×106mL-1,分装于1mL的冻存管,置4℃40~6
6、0min后,再置-20℃2h,于-80℃冰箱过夜,最后置液氮中。复苏细胞时将冻存管迅速放入37℃温水中融化,加培养液3mL混悬,离心,弃上清,加入含20%FBSαMEM培养液,接种于培养瓶中培养。 1.2.1.2流式细胞术检测调整第4代rMSC细胞浓度为(1~3)×106mL-1,分装6管,每管100μL,每2管1组。分别加入CD34PE与CD45FITC抗体。于4℃避光孵育30min后检测。 1.2.1.3荧光染料CTO标记rMSC参照文献[8]。将10mmol/LCTO二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)贮存液配制成1μmol/L标记液
7、。当rMSC长满瓶底时加入标记液5mL,37℃孵育45min,吸掉标记液,加入无血清培养基5mL,37℃孵育30min,于荧光显微镜下观察细胞均发出红色荧光。 1.2.2线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型参照文献[9]方法并改进。大鼠2%戊巴比妥钠(45mg/kg)腹腔麻醉,仰卧固定于手术台,分离左侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉(ICA),结扎并游离ECA及其分支,沿ICA向下分离翼腭动脉(PPA),用线将其悬吊。夹闭CCA和ICA,于ECA残端起始部剪一小口,由此口轻轻插入直径0.23mm末端成球状的尼龙线,至大脑中动脉(MCA
