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1、结核杆菌H37Ra免疫小鼠后脾淋巴细胞的杀伤活性及免疫机制的研究论文.freelphocytesandimmunemechanismsinmiceimmunizedbyMycobacteriumtuberculosisH37RaAbstractAIM:ToexplorethespecificcytotoxicityofspleenlymphocytesandtheimmunemechanismsinmiceimmunizedbyMycobacteriumtuberculosis（MTB）H37Ra.METHOD
2、S:Atthevariousinterval(30days,60days)afterthemicemunizedbyMTBH37Ra,BCGandPBS,thespleenlymphocytesoftheimmunizedmicephocytesintheimmunizedmiceeasuredbyMTTassay.SpleenlymphocytesmunizationandstimulatedeBonmRNAlevelphocytesinthegroupimmunizedbyMTBH37RaRNAexpres
3、sionofperforin,granzymeBinH37RagroupandBCGgroupRNAinH37RagroupeBmRNAbetphocytesisenhancedaftermicemunizedbyMTBH37Ra,ayberelatedtotheexpressionofperforinandgranzymeB.Keyphocyte;perforin;granzymeB摘要目的:探讨结核杆菌H37Ra免疫小鼠后,产生特异性的脾淋巴细胞杀伤活性及其免疫机制。方法:(1)分别以结核杆菌H37Ra、B
4、CG和PBS免疫小鼠后第30天及第60天,分离各组小鼠脾淋巴细胞作为效应细胞,以表达Ag85B分泌蛋白的Sp2/0细胞为靶细胞,用MTT比色法检测免疫小鼠脾淋巴细胞的杀伤率;(2)在免疫后第60天,小鼠脾淋巴细胞经PPD刺激后,以RTPCR法检测穿孔素mRNA及颗粒酶BmRNA的表达。结果:(1)结核杆菌H37Ra组脾淋巴细胞的杀伤率明显高于PBS对照组(P0.05),略高于BCG组;(2)H37Ra组和BCG组穿孔素、颗粒酶mRNA的表达量均显著高于PBS组（P0.05）,H37Ra组穿孔素mRNA的表达量显
5、著高于BCG组(P0.05),但颗粒酶BmRNA的表达量两组无差异。结论:结核杆菌H37Ra免疫小鼠后,能增强脾淋巴细胞的杀伤活性,其机制可能与增加穿孔素、颗粒酶B的表达有关。关键词结核杆菌H37Ra;Ag85B蛋白;小鼠淋巴细胞;穿孔素;颗粒酶B近年来,由于人口流动的增加,多重耐药菌株的流行,以及结核分枝杆菌（MTB）和HIV的双重感染,导致TB的发病率和死亡率大副度提高。而目前惟一获准使用的卡介苗（BCG）的预防效果又不甚理想,对不同的人群保护力差异较大,因此,世界各国加强了对宿主抵抗结核杆菌免疫机制的研究
6、。H37Ra是由H37Rv（人型结核分枝杆菌标准毒株）多次传代后获得的无毒株。国内外文献报道,H37Ra具有毒力较低、抗原性完整1,2及能充分活化巨噬细胞3,4等优点,因此,结核杆菌H37Ra作为侯选减毒活疫苗具有相对的优势。然而如何提高CD8+T细胞的特异性杀伤活性,是研制新型抗结核疫苗迫切需要考虑的问题。以往结核疫苗的研究中,有关特异性小鼠脾淋巴细胞杀伤作用的研究较比浮浅。Ag85B是结核分枝杆菌的主要分泌蛋白,可诱发对MTB的保护性免疫应答。本研究中拟用能表达此目的蛋白的Sp2/0细胞为靶细胞,检测结核杆
7、菌H37Ra免疫小鼠后,诱导机体产生特异性脾淋巴细胞杀伤活性的效果,并从分子水平上检测穿孔素、颗粒酶mRNA的表达,以探讨小鼠脾淋巴细胞抗MTB感染的免疫机制。1材料和方法1.1材料携带有Ag85B分泌蛋白基因的真核表达质粒pTB30m,由华中科技大学同济医学院微生物教研室范雄林博士馈赠,本室保存。结核杆菌H37Ra、BCG菌株由本室保存。Sp2/0细胞由重庆医科大学感染病研究所提供。Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司。总RNA提取试剂Trizol购自上海生工公司。RTPCR试剂
8、盒购自TaKaRa公司。PPD标准品购自成都市生物制品研究所。抗Ag85B分泌蛋白的多克隆抗体本室制备。HRP标记的羊抗鼠IgG及二氨基联苯胺(DAB)购自北京中杉公司。G418、RPMI1640培养液、MTT和淋巴细胞分离液,均购自北方同正公司。小牛血清购自GIBCO公司。SPF雌性C57BL/6小鼠,6～8周龄,质量18～20g,购自重庆医科大学实验动物中心。1.2方法1.2.1实
