猪链球菌的分离与鉴定

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1、猪链球菌的分离与鉴定2000年4月，陕西省岐山县种猪繁育场仔猪流行关节炎和败血症。无菌采取患关节炎猪的关节液和患败血症猪的肝、肺、脾及肠系膜淋巴结各8份病料，并对这16份病料进行病原菌分离试验、血清学鉴定、致病力试验、保护力试验、细菌回收试验、药敏试验。结果表明：该病原菌为2型猪链球菌，引起关节炎的猪链球菌较引起败血症的猪链球菌致病力弱；该菌对头孢菌素、青霉素高度敏感。关键词：猪链球菌分离与鉴定论文完成日期：2000年6月15日目录摘要1前言21.试验材料……………….22.方法…………………….22.1病原分离……………..22.2分离菌株的鉴定……..22.3致病力及保护力试验

2、..32.4药敏试验……………..33.结果…………………….43.1分离菌的培养特性及形态特征….………….43.2生化试验结果………..53.3血清学鉴定结果……..53.4致病力试验及保护力试验结果……………..53.5细菌回收试验结果…..53.6药敏试验结果………..54分析与讨论…………….62．2．2血清学鉴定将3#、8#、13#、15#菌经缓冲肉汤培养8h，通过3000r/min离心10min，PBS洗涤2次，用Ph7.2的0.01mol/LPBS制成1*1010~2*1010细菌悬液。取1滴上述细菌悬液与适当的抗血清在洁净玻片上混匀，立即观察凝集现象。同时，设立细

3、菌悬液对照及血清对照。2．3致病力及保护力试验2．3．1菌落形成单位的测定按常规方法进行[9]2．3．2致病力试验无菌吸取上述血清肉汤培养物（含菌量5.0*108CFU/ml）以0.1ml/只、0.2ml/只、0.3ml/只、0.4ml/只、0.5ml/只分别腹腔注射小白鼠2只，观察其死亡时间和数量，测定其最小致死量。再将上述血清肉汤培养物腹腔注射小白鼠，小白鼠共14只，分7组。第一组，每只小白鼠注射3#菌0.2ml，第二组每只注射8#菌0.2ml，第三组每只注射3#、8#菌各0.1ml，第四组每只注射13#菌0.2ml，第五组每只注射15#菌0.2ml，第六组每只注射13#、15

4、#菌各0.1ml，第七组每只注射无菌血清肉汤1.0ml。以上各组分别饲养观察其死亡时间及数量。2．3．3保护力试验将3#、8#、13#、15#血清肉汤培养物分别接种于18cm鲜血平板。37℃培养24h后，收菌，用麦氏比浊管比浊，适当稀释，然后用0.3%甲醛灭活；37℃作用24h；作无菌检验。然后分别腹部皮下接种小白鼠2只，0.4ml/只。10天后，再分别人工感染，0.2ml/只。2．3．4细菌回收试验对致病力试验出现症状及死亡小白鼠剖检，并采集病料，进行分离。2．4药敏试验采用纸片扩散法，用无菌棉签蘸取分离菌的血清肉汤培养物，均匀涂布于9cm鲜血平板；待稍干后，用无菌镊子将各种药敏

5、纸片分别平贴在培养基表面，4℃2h使药物扩散，然后置37℃培养20—24h，观察结果。结果按抑菌圈直径大小和各抗菌药的具体标准，评定为高度敏感、中度敏感或耐药。结果评定参照表1。表1各种抗菌药物的抑菌圈与敏感标准抗菌药物名称抑菌圈直径（mm）耐药中度敏感高度敏感青霉素土霉素洁霉素链霉素庆大霉素卡那霉素头孢菌素13>15>15>15>15>15>153．结果3．1分离细菌的培养特性及形态特征3．1．1培养特性37℃培养24h后，所采的12份病料在鲜血琼脂平板上形成表面光滑、隆起的灰绿色小菌落，外层有明显的β溶血环。该菌在匹克氏增菌液中底部有沉淀，在血清肉汤中先均匀浑浊，后在试管底部形

6、成沉淀，上部澄清，不形成菌膜。3．1．2染色特性关节液、鲜血琼脂、匹克氏增菌液及血清肉汤培养物涂片、革兰氏染色、显微镜检查为革兰氏阳性，在关节液、鲜血琼脂培养物中多呈单个、双球或短链状排列，在匹克氏增菌液及血清肉汤培养物中多呈长链状。3．2生化试验结果（见表2）表2分离菌生化试验结果鉴定蔗糖山梨棉实葡萄甘露蕈糖乳糖菊糖水杨马尿项目醇糖糖糖苷酸钠3#+--++++++-8#+--++++++-13#+--++++++-15#+--++++++-判定标准：“+”表示大多数（90%—100%）菌株为阳性；“-”表示大多数（90%—100%）菌株为阴性。表2表明分离的3#、8#、13#、1

7、5#菌的生化反应结果均符合猪链球菌的生化特性，说明分离的菌均为猪链球菌。3．3血清学鉴定结果将3#、8#、13#、15#细菌悬液与1/2及2型抗血清混合，立即可见明显的凝集现象，但不与1型及其他型抗血清出现凝集。直接挑取细菌菌落与血清混匀，也能得到一致结果。阴性对照均未见凝集现象。3．4致病力试验结果及保护力试验结果3．4．1致病力试验结果第一组、第二组小白鼠注射血清肉汤培养物48h内均未见死亡，第三组48h内有一只死亡，第四组、第五组、第六组在注射血清肉汤培养物18