秦巴山区孕妇人巨细胞病毒宫内感染与ul54、ul97基因突变的关系论文

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1、秦巴山区孕妇人巨细胞病毒宫内感染与UL54、UL97基因突变的关系论文盛秋，李芬，于学文，李琦，韩蓁，李学成，任永惠【摘要】目的探讨秦巴山区孕妇妊娠期人巨细胞病毒(HCMV)宫内感染与HCMVUL54、UL97基因突变的关系。方法采用PCR方法检测228对孕妇血清和新生儿脐血血清中的HCMVDNA，对HCMVDNA阳性者采用限制性片段长度多态性(PCRRFLP)方法检测HCMVUL54、UL97基因501、594及595密码子是否发生突变。结果①228例孕妇血清中HCMVDNA阳性者19例.freelancytomegalovirus,HCMV)是

2、人类先天性感染的常见原因之一，在人群中感染广泛。孕妇感染HCMV后可导致流产、早产、死胎、胎儿宫内发育迟缓、新生儿先天畸形、新生儿并发症及远期后遗症等。本课题既往对秦巴山区的研究调查表明，该地区孕妇孕期HCMV感染率为19.59%，明显高于国内外文献的报道1。目前对HCMV导致胎儿损害的机制尚不能做出完善的解释。近年来，从分子水平研究HCMV的发病机制是倍受关注的热点。本研究在国内首次采用分子生物学的方法探讨秦巴山区孕妇妊娠期宫内HCMV感染与基因突变的关系，以期揭示其发病机理，采取有效的防治措施，最终达到提高出生人口素质的目的。1资料与方法1.1研

3、究对象选取2002年5月至2005年7月秦巴山区2县4乡住院分娩的单胎孕妇228例作为研究对象。孕妇年龄20-36(25.83±2.23)岁，孕周35-41周，其中自然分娩189例，剖宫产39例(均为产科因素)。分娩时成对采集孕妇肘静脉血及新生儿脐带血(脐血在胎儿娩出后未断脐时于脐带胎儿端抽取)，每份样本5mL，分离血清后于-70℃保存。所有孕妇均无妊娠合并症，无风疹病毒、弓形虫及单纯疱疹病毒活动性感染，且排除家族性遗传性疾病。1.2方法1.2.1基因片段的PCR扩增盐析法提取HCMVDNA。UL54基因的扩增及检测：所用引物为5χCGCCACCA

4、AGGTGTATAT3χ和5χAGTGGTTGGGCAGGATAA3χ，反应体系为25μL。体系中含有10×PCRBuffer2.5μL，dNTP混合液0.5μL，MgCl2(25mmol/L)1.5μL，引物混合液0.5μL，模板2μL，TaqDNA聚合酶(u/μL)1μL，无菌去离子水17μL，无菌液体石蜡20μL。循环条件为：94.5℃50s，55℃45s，72℃50s，共35个循环，最后72℃7min。20g/L琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。UL97的扩增及检测：所用引物为5χCGGTCTGGACGAGGTGCGCAT3χ和5χAATGAG

5、CAGACAGGCGTCGAAGCAGTGCGTGAGCTTGAAGTTCTT3χ。反应体系同上。循环条件为：94.5℃1min，51℃45s，72℃50s，共40个循环，最后72℃7min。20g/L琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。1.2.2PCRRFLP检测基因突变①UL54基因501密码子的检测：扩增后的UL54片断用限制性内切酶AluⅠ在37℃水浴箱2h进行酶切，3g/L琼脂糖凝胶检测酶切结果。②UL97基因594、594密码子的检测：扩增后的UL97片断分别用限制性内切酶HhaⅠ在37℃水浴箱2h进行酶切及TaqⅠ在65℃水浴2h进行酶切，酶

6、切产物用100g/L聚丙烯酰氨凝胶电泳检测。1.3统计学处理采用SPSS11.0软件对数据进行处理，计数资料采用Fisher精确概率法进行统计学检验，显著性标准为α=0.05。2结果2.1孕妇HCMV宫内感染情况228例配对血中，孕妇血清HCMVDNA(＋)19例，阳性率为8.33%；新生儿脐血血清HCMVDNA(＋)8例，阳性率为3.51%。在19例HCMVDNA(＋)孕妇中,其配对脐血阳性7例，HCMV宫内传播率为36.84%；209例HCMVDNA(-)的孕妇血清中脐血阳性1例，阳性率为0.48%。可见孕期HCMV活动性感染与胎儿宫内感染有显著

7、相关性(χ2＝55.11，P0.005)。2.2孕妇血清及新生儿脐血中HCMVDNA的检测经PCR扩增后得到UL54的扩增片段，产物为核苷酸2075-2460，长度为386bp，其中包含密码子501(图1)。经PCR扩增后得到UL97的扩增片段,产物为核苷酸1713-1830，长度为118bp,其中包含密码子594和595(图2)。2.3.1UL54密码子501突变在HCMV野生型病毒株的上述UL54片段扩增产物中包含一个AluⅠ识别位点，被AluⅠ消化后产生283bp和103bp两个片段；在HCMV突变病毒株中核苷酸2160处的碱基T→C，密码子5

8、01发生改变，AluⅠ酶切后可产生283bp、85bp和18bp三个片段。本研究HCMVDNA阳性孕妇血清及