巯基受损对内皮细胞no系统的影响论文

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1、巯基受损对内皮细胞NO系统的影响论文【摘要】目的通过检测巯基螯合剂DEM对内皮细胞二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)活性的影响，探讨马来酸二乙酯(DEM)对内皮细胞NO通路功能障碍的影响。方法找出处理内皮细胞时DEM作为巯基螯合剂的最适剂量和时间。以最适DEM剂量和时间预处理内皮细胞后，继续培养24小时，检测各时间段的DDAH活性及NO含量。结果DEM最适剂量为0.6umol/L，最适作用时间为30分钟。经DEM预处理后DDAH活性随之降低，至2小时时达最低值，以后DDAH活性逐渐恢复；NO含量在DEM预处理后显示相似的改变。结论DEM可导致内皮细胞NO通路

2、功能障碍。提示DDAH活性降低可能与DDAH的巯基受损有关，进一步提示保护DDAH的巯基是对抗各种NO通路功能障碍因素的重要途径之一。【关键词】谷胱甘肽(GSH)二甲基精氨酸二甲胺水解酶（DDAH）一氧化氮(NO)氧化应激AbstractObjectiveToinvestigatetheeffectofDEMonthefunctionofNOpathpactofDEMontheactivityofDDAHinendothelialcells.MethodsThemostsuitabledosageandthebesttimeofDEMassulfhydrylc

3、helatingagente,theendothelialcellseintervalsostsuitabledosageofDEMol/Leinutes;afterthepro-treatmentofDEM,.freelountedup;similarchangesentofDEM.ConclusionsDEMmayleadtothedysfunctionofNOpathayberelatedageofDDAHanditisfurtherindicatedthattoprotectthesulfhydrylofDDAHisoneofthemostimport

4、antconfrontationstovariousfactorsofdysfunctionofNOpathethylargininedimethylaminohydrolase(DDAH)Nitricoxide(NO)oxydativestress内皮细胞分泌的一氧化氮(NO)是调控心血管功能的最重要因子之一.freela公司；NO试剂盒，南京建成生物工程研究所。1.4ECV304细胞的培养本实验采用人脐带静脉内皮细胞株(ECV304细胞)。细胞生长于完全M199培养基(含10％胎牛血清，20mmol/LHepes、100U／ml的青霉素和100Ug／ml的

5、链霉素)，培养条件为37℃，5％CＯ2，饱和湿度。细胞传代时以0．25％的胰酶消化，稀释成1×１06／ml的细胞悬液接种。1.5细胞生长抑制试验以不同浓度DEM作用于内皮细胞不同时间段，以MTT法检测不同DEM浓度作用下的ECV304细胞的存活率。将细胞消化后，接种于96孔板每孔200ul。将培养板放入CO2孵箱中培养24或48小时换无血清培养基再继续培养24到48小时以使细胞同步化，加药。DEM用前先用乙醇溶解，然后用培养基倍比稀释成不同的浓度，每个浓度梯度8个孔，作用30分钟洗去所加药，加无血清培养基再孵育24小时后，做MTT检测。实验结果以细胞存活率表示

6、，即：细胞存活率（%）=实验组吸光度/对照组吸光度×100%。1.6细胞内GSH含量的测定取对数生长期的细胞，胰酶消化成细胞悬液，台盼蓝计数活细胞，并按5×105浓度接种于25cm2培养瓶，实验组按照6个不同的检测点分成6大组，分别为0、0.5、2、6、12、24小时组。分别设对照组与加药组。加药组在0.6μmol/L的马来酸二乙酯（DEM）预处理30分钟后去除DEM，换成无血清培养基继续培养0、0.5、2、6、12、24小时后收集细胞，对照组无DEM处理的步骤。在各时间点将细胞破碎(超声破碎细胞)取上清用于GSH的检测，取0.2ml细胞上清液用1.8ml的磷

7、酸钠EDTA缓冲液稀释，再从稀释液中取出0.1ml加1.9ml缓冲液，混匀加入0.1mlOPT甲醇溶液，混匀室温静置30分钟待测。根据标准曲线计算GSH值。1.7DDAH活性的检测细胞分组，各组细胞消化成单细胞悬液后调节细胞数为每样本1x106，完全裂解细胞，将细胞裂解液离心1500转/分，40分钟。上清液用于DDAH活性的检测［2］。上清液用4mmol/L的ADMA和0.1mol/L的磷酸缓冲液(PH6.5)共0.5ml共同于37℃孵育2小时，然后加入同等体积的10%的三氯醋酸终止反应，上清液加0.8%［l(溶于5%醋酸)和0.5%［l(溶于50%硫酸)

8、，60℃共煮110分钟，生成的L瓜氨