巯基受损对内皮细胞no系统的影响

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1、巯基受损对内皮细胞NO系统的影响【摘要】　　目的通过检测巯基螯合剂DEM对内皮细胞二甲基精氨酸二甲胺水解酶(DDAH)活性的影响，探讨马来酸二乙酯(DEM)对内皮细胞NO通路功能障碍的影响。方法找出处理内皮细胞时DEM作为巯基螯合剂的最适剂量和时间。以最适DEM剂量和时间预处理内皮细胞后，继续培养24小时，检测各时间段的DDAH活性及NO含量。结果DEM最适剂量为0.6umol/L，最适作用时间为30分钟。经DEM预处理后DDAH活性随之降低，至2小时时达最低值，以后DDAH活性逐渐恢复；NO含量在DEM预处理后显示相似的改变。结论DEM可导致内皮细胞NO通路功

2、能障碍。提示DDAH活性降低可能与DDAH的巯基受损有关，进一步提示保护DDAH的巯基是对抗各种NO通路功能障碍因素的重要途径之一。【关键词】谷胱甘肽(GSH)二甲基精氨酸二甲胺水解酶（DDAH）一氧化氮(NO)氧化应激　　AbstractObjectiveToinvestigatetheeffectofDEMonthefunctionofNOpathpactofDEMontheactivityofDDAHinendothelialcells.MethodsThemostsuitabledosageandthebesttimeofDEMassulfhydrylc

3、helatingagente,theendothelialcellseintervalsostsuitabledosageofDEMol/Leinutes;afterthepro-treatmentofDEM,theactivityofDDAHdecreasedandreachedtheloountedup;similarchangesentofDEM.ConclusionsDEMmayleadtothedysfunctionofNOpathayberelatedageofDDAHanditisfurtherindicatedthattoprotectthesu

4、lfhydrylofDDAHisoneofthemostimportantconfrontationstovariousfactorsofdysfunctionofNOpathethylargininedimethylaminohydrolase(DDAH)Nitricoxide(NO)oxydativestress　　内皮细胞分泌的一氧化氮(NO)是调控心血管功能的最重要因子之一，NO通路的功能障碍参与了动脉粥样硬化的发生发展。氧化应激被认为是引起内皮NO系统功能障碍的重要原因。研究证实，NO合酶抑制物不对称二甲基精氨酸(ADMA的增多可能是造成NO通路功能

5、障碍的重要机制之一。而ADMA在体内的增多主要与其分解代谢酶二甲基精氨酸二甲胺水解酶（DDAH）的功能障碍密切相关［1，2］。DDAH活性中心的半胱氨酸残基(SH)被认为是各种因素素作用于DDAH活性的靶点。为探讨此种可能性，我们以巯基耗竭剂马来酸二乙酯(DEM)作用于内皮细胞，因为已有实验证实，DEM可以通过与GSH发生鳌合迅速而短暂地消耗细胞内的GSH［3］，但DEM是否可对DDAH产生相似的影响尚未见报道。　　１材料和方法　　1.1药品和试剂小牛血清、RPMI1640培养基、DEM、二乙酰一肟、安替比林、三氯醋酸、邻苯二醛、N乙基马来酰亚胺。　　1.

6、2细胞株内皮细胞株ECV304由四川大学免疫教研室提供。　　1.3仪器CO2培养箱（德国Heraeus公司）；荧光分光光度计（日本岛津公司）；550型酶标仪（Biorad公司）；不对称二甲基精氨酸ADMA购自Sigma公司；NO试剂盒，南京建成生物工程研究所。　　1.4ECV304细胞的培养本实验采用人脐带静脉内皮细胞株(ECV304细胞)。细胞生长于完全M199培养基(含10％胎牛血清，20mmol/LHepes、100U／ml的青霉素和100Ug／ml的链霉素)，培养条件为37℃，5％CＯ2，饱和湿度。细胞传代时以0．25％的胰酶消化，稀释成1×１06／ml

7、的细胞悬液接种。　　1.5细胞生长抑制试验以不同浓度DEM作用于内皮细胞不同时间段，以MTT法检测不同DEM浓度作用下的ECV304细胞的存活率。将细胞消化后，接种于96孔板每孔200ul。将培养板放入CO2孵箱中培养24或48小时换无血清培养基再继续培养24到48小时以使细胞同步化，加药。DEM用前先用乙醇溶解，然后用培养基倍比稀释成不同的浓度，每个浓度梯度8个孔，作用30分钟洗去所加药，加无血清培养基再孵育24小时后，做MTT检测。实验结果以细胞存活率表示，即：细胞存活率（%）=实验组吸光度/对照组吸光度×100%。　　1.6细胞内GSH含量的测定取对数生长

8、期的细胞，胰酶消化成细胞