特异性1023脱氧核酶对肝癌相关基因igfⅱmrna的体外切割作用

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1、特异性1023脱氧核酶对肝癌相关基因IGFⅡmRNA的体外切割作用【关键词】原发性肝细胞肝癌；基因治疗；胰岛素样生长因子Ⅱ；脱氧核酶　　人胰岛素样生长因子Ⅱ（insulinlikegroes，DRz）是具有RNA切割功能的单链DNA分子，通过两边的底物结合臂与靶mRNA特异性结合后，对靶mMRA具有高效、特异的切割作用，从而可以在mRNA水平上抑制基因的表达，达到基因治疗的目的。本研究共设计3条针对IGFⅡmRNA的DRz，观察其在体外对靶mRNA的切割作用，探讨脱氧核酶在肝癌基因治疗方面的应用前景。　　1材料与方法　　1.1材料　　HepG2肝癌细胞由长春肿瘤研究所提供

2、，PGEM3Z质粒、JM109菌株和T7体外转录试剂盒均购自Promega公司，RTPCR试剂盒、DNA连接试剂盒、DNA片段纯化试剂盒、质粒DNA小量纯化试剂盒、Trizol试剂、核酸内切酶EcoRⅠ和HindⅢ均购自Takara公司。　　1.2方法　　1.2.1细胞总RNA的提取　　用含有10%血清的培养液培养HepG2肝癌细胞至70%融合期，收集细胞，用Trizol试剂提取总RNA。　　1.2.2IGFⅡcDNA片段的获得　　根据GenBank中IGFⅡ基因序列设计两对引物，采用巢式PCR扩增出长度为331bpDNA片段。第一轮PCR反应上游引物F1：5′GCTCT

3、GCCCCGTCGCACATTC3′，下游引物R1：5′CGGGGTATCTGGGGAAGTTG3′，扩增产物长度为475bp；第二轮PCR反应上游引物F：5′gaattcCTGTTCGGTTTGCGACAC3′，下游引物R：5′aagcttGTAGCACAGTACGTCTCCAG3′，扩增产物长度为331bp，小写字母部分分别为EcoRⅠ和HindⅢ的酶切位点。引物由大连宝生物工程公司合成。　　以R1为特异性引物，以提取的总RNA为模板合成cDNA，反应条件为42℃，60min，99℃5min灭活AMV，5℃5min。取RT产物10μl，以F1和R1为引物，进行第一轮PCR扩增

4、，反应条件为94℃预变性10min，94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸30s扩增30个循环，72℃延伸10min。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色观察结果。以F和R为引物，PCR产物为模板，进行二次PCR扩增，反应条件同上。　　1.2.3重组质粒的构建及鉴定　　将第二轮PCR回收产物和PGEM3Z质粒用EcoRⅠ和HindⅢ37℃酶切4h，切胶回收目的片段，16℃水浴反应60min，构建PGEM3ZIGFⅡ质粒，具体方法按分子克隆实验指南操作。挑取阳性克隆进行双酶切鉴定后进行测序。　　1.2.4IGFⅡmRNA的获取　　抽提纯化重组质粒PGEM

5、3ZIGFⅡ，用HindⅢ将质粒进行单酶切，使之线性化后用T7体外转录试剂盒获取IGFⅡmRNA，步骤参照说明书进行。　　1.2.5不同位点1023DRZ对靶RNA的切割反应　　首先采用RNAStructure4.2软件对IGFⅡmRNA的二级结构进行分析，针对IGFⅡmRNA的起始区和编码区的保守位点分别设计脱氧核酶DRz1、DRz2和DRZ3作为对照，设计针对相同底物的17nt的反义寡聚脱氧核苷酸（ASODN）。DRz1：5′GATTCCCAGGCTAGCTACAACGATGGTGTCT3′；DRz2：5′CACCAGCAGGCTAGCTACAACGACGA

6、CTTCC3′；DRz3：5′AAACAGCAGGCTAGCTACAACGATCCTCAAC3′。划线部分为DRz的活性中心，未划线部分为底物结合臂。ASODN1：5′GATTCCCATTGGTGTCT3′；ASODN2：5′CACCAGCATCGACTTCC3′；ASODN3：5′AAACAGCACTCCTCAAC3′。将DRz1、DRZ2和DRz3各5pmol分别与底物RNA5pmol混合，总反应体系20μl。在37℃、TrisHcl（pH7.4）50mmol/L、MgCl210mmol/L条件下，反应20min后，加入等体积的甲酰胺上样缓冲液终止反应。加

7、入ASODN作为阳性对照，未加入DRz作为阴性对照。将反应物95℃变性5min后置冰上，用含7mol/L尿素的8%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色观察结果。　　2.2不同位点1023DRz对靶mRNA的切割反应　　各体系反应完成后，经8%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，显示DRz1具有切割底物RNA的活性，而DRz2和DRz3及阳性对照ASODN均未显示出切割活性（图3）。　　　　3讨论　　由于原发性肝细胞性肝癌（HCC）的生存期短，发展快，转移早，预后差，因此传统的手术、放疗、化疗