脱氧核酶抑制细菌tem

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1、脱氧核酶抑制细菌TEM作者：刘刚凌保东谢勇恩林丽赵廷坤雷军【摘要】目的观察10-23脱氧核酶对细菌TEM-1酶基因表达的抑制作用。方法PCR扩增TEM-1酶全编码基因，将其连接入pBK-CMV载体中，并在大肠埃希菌JM109中表达。设计并合成针对blaTEM-1的10-23脱氧核酶、反义寡核苷酸，采用氯化钙法将其分别导入表达blaTEM-1的大肠埃希菌中，观察细菌导入脱氧核酶后，在含氨苄西林(100μg/ml)培养基中的生长活力及β-内酰胺酶活性的变化。结果10-23脱氧核酶导入表达blaTEM-1的大肠埃希菌后，在含氨苄

2、西林(100μg/ml)的培养基中大肠埃希菌的生长活力明显低于反义寡核苷酸和空白对照组，导入脱氧核酶的大肠埃希菌β-内酰胺酶活性也明显低于反义寡核苷酸和空白对照组。结论10-23脱氧核酶能特异性地抑制细菌blaTEM-1酶基因表达。【关键词】耐药性；β-内酰胺酶；脱氧核酶；基因表达ABSTRACTObjectiveToinvestigatetheinhibitoryeffectsof10-23deoxyribozyme(10-23DRz)onblaTEM-1geneexpressioninE.coli.Methodsbla

3、TEM-1geneplifiedbypolymerasechainreaction(PCR),thetargetamplificationfragmentinationpositionmethod.AccordingtothegenesequenceofblaTEM-1,10-23DRzandantisenseoligonucleotides(As-ODN)ediumcontainingampicillin(100μg/ml)andβ-lactamaseactivityetrically.ResultsA600valueo

4、fE.coliincubatedaseactivityof10-23DRzgroupases;Deoxyribozyme;Geneexpression针对细菌产生β-内酰胺酶是导致其对β-内酰胺类抗生素耐药的主要原因［1～3］，近年来，国内外学者致力于探索抑制β-内酰胺酶的有效措施并研制出了一系列的β-内酰胺酶抑制剂，如克拉维酸，舒巴坦、三唑巴坦等，但随着β-内酰胺类抗生素与酶抑制剂复合制剂在全球范围的广泛使用，对酶抑制剂耐药的β-内酰胺酶也随之不断出现［3］，为临床用药带来巨大困难。探索其它方法、措施以解决β-内酰胺酶所

5、导致耐药问题意义重大，本实验以耐药基因blaTEM-1的mRNA为靶点，观察10-23脱氧核酶作为新型酶抑制剂的抑酶效应，为研制开发新型抗感染性疾病基因治疗药物提供理论依据。1材料与方法1.1菌株产TEM-1型β-内酰胺酶菌株、大肠埃希菌JM109及PBK-CMV载体为本所保存。1.2主要试剂氨苄西林(齐鲁制药厂)；质粒DNA小量快速制备试剂盒、dNTP、Taq酶和PCR反应配套试剂(上海申能博采公司)；DNADL2000Marker、限制性内切酶EcoRI、BamHI和DNA连接试剂盒(宝生物大连有限公司)。1.3主要仪

6、器TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；PTC-150型PCR仪及GDS-2000多功能凝胶成像和分析系统(美国MJResearch有限公司)。1.4blaTEM-1片段的PCR扩增编码框以外设计blaTEM-1通用引物，(P1：5′-GCGGATCCCATGAGTATTCAACATTTC-3′，P2：5′-GCGAATTCTTAGCGTTGCCAGTGCTC-3′)，引物5′分别引入EcoRI和BamHI酶切位点，由上海申能博彩公司合成。用煮沸法提取DNA，进行PCR扩增，PCR扩增条件

7、为：先94℃预变性3min，然后进入循环，循环参数为：94℃变性1min，55℃复性1min，72℃延伸1min，共30个循环，末次循环自动延伸7min。取5μl扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。1.5PCR产物的纯化、克隆及表达按照PCR产物纯化试剂盒的要求，纯化目的片断，经EcoRI和BamHI酶切与经EcoRI和BamHI酶切后的PBK-CMV(含有卡那霉素抗性基因)连接。连接反应液转化至大肠埃希菌JM109感受态细胞，经含氨苄西林(50μg/ml)/卡那霉素(50μg/ml)的麦康凯培养基筛选。挑取白色菌落，接种

8、于含氨苄西林的LB培养液中，37℃培养过夜。用碱裂解法提取重组菌株中的质粒，经EcoRI和BamHI酶切鉴定。Nitrocefin显色法对重组菌产β-内酰胺酶进行定性检测。1.6核苷酸序列测定及分析重组质粒送上海基康生物公司测序，测序结果采用国际互联网上NCBI的BLAST工具进行同源性检索分析。1.7