类手枪脱氧核酶在糖传感器中的设计应用

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1、分类号：Q55单位代码：10183研究生学号：2013342045密级：公开吉林大学硕士学位论文（学术学位）类手枪脱氧核酶在糖传感器中的设计应用Designandapplicationofapistol-likeDNAzymeinsugarsensors作者姓名：刘程程专业：生物化学与分子生物学研究方向：脱氧核酶酶学与酶工程指导教师：姜大志副教授培养单位：生命科学学院2016年5月类手枪脱氧核酶在糖传感器中的设计应用Designandapplicationofapistol-likeDNAzymein

2、sugarsensors作者姓名：刘程程专业名称：生物化学与分子生物学指导教师：姜大志副教授学位类别：理学硕士答辩日期：2016年6月3日未经本论文作者的书面授权，化法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行巧何形式的复制、修改、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限）。否则，应承担侵权的法律责任。吉林大学硕女学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作

3、所取得的成果。除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名；曰期：＇年月＾曰＞０＾（中文摘要上世纪80年代初，Cech和Altman等分别在内含子和RNaseP中发现了具有催化功能的RNA分子，称为核酶（RNAzyme，ribozyme）。核酶的发现改变了“酶即蛋白质”这一传统学术观念，继而引发了对DNA催化功能的研究

4、。1994年，Breaker和Joyce首次报道了一种Pb2+依赖且具有断裂RNA活性的DNA分子，其反应动力学遵循米氏方程，这类具有特异性催化功能DNA称之为脱氧核酶（DNAzyme，deoxyribozyme）。迄今为止，生物体内天然存在的脱氧核酶尚未被发现，所有催化类型脱氧核酶都是通过体外进化筛选获得，其中具有断裂活性脱氧核酶占多数，例如类手枪脱氧核酶（pistol-likeDNAzyme，PLDz）。该脱氧核酶是Breaker实验室以“Cu2+/维生素C”为辅因子通过体外进化筛选获得的一种具有

5、自身断裂活性的单链DNA分子，其催化机制被认为是自由基介导的DNA氧化断裂反应。在Breaker等人的研究基础上，我们对类手枪脱氧核酶的酶学性质、构效关系以及催化机制等方面进行了较为深入研究。本论文将重点介绍该脱氧核酶在葡萄糖和蔗糖传感器方面的应用研究。根据类手枪脱氧核酶催化活性与辅因子之间关系，我们设计了一种双酶偶联型葡萄糖传感器GOx-PLDz1.0，其检测原理为：样品中β-D-葡萄糖作为一级信号分子被葡萄糖氧化酶识别并将其催化生成葡萄糖酸和H2O2，H2O2作为二级信号分子被类手枪脱氧核酶识别，

6、在H2O2和二价金属离子存在下，该脱氧核酶发生自身断裂反应，断裂程度与溶液中葡萄糖浓度关系符合“DoubleBoltzmann”方程。GOx-PLDz1.0传感器葡萄糖检测下限5μM，利用该传感器对泪液和唾液中葡萄糖含量进行了检测，其含量分别为720±81和405±56μM，实现了非创伤方式检测体内葡萄糖含量。在GOx-PLDz1.0设计基础上，我们引入反式结构类手枪脱氧核酶构建GOx-PLDz1.1，表明反式结构类手枪脱氧核酶可以作为新一代葡萄糖传感器元件。为提高葡萄糖传感器实用性和操作性，我们在G

7、Ox-PLDz1.0和1.1基础上发展出一种高灵敏荧光型葡萄糖传感器GOx-PLDz2.0。GOx-PLDz2.0的检测原I理与GOx-PLDz1.0和1.1的检测原理相同，最大的区别之处在于信号输出部分，我们在类手枪脱氧核酶与底物化学修饰荧光/淬灭分子，当葡萄糖存在时，GOx-PLDz2.0发射荧光信号，可大幅提高传感器检测灵敏度。荧光信号强度与葡萄糖浓度之间关系符合“Extreme”方程，葡萄糖浓度检测下限为50nM。利用GOx-PLDz2.0传感器，我们对10个唾液样品进行检测分析。在类手枪脱氧

8、核酶构效关系研究中，我们发现了一个活性增强的突变体PLDz-T3G。我们将蔗糖酶、葡萄糖氧化酶以及类手枪脱氧核酶突变体（PLDz-T3G）组合，在葡萄糖传感器GOx-PLDz1.0基础上设计了三酶偶联型蔗糖传感器IGP1.0，其蔗糖检测下限为5μM。葡萄糖氧化酶预处理后，IGP1.0传感器表现出较强的抗干扰性。利用该传感器我们对8种饮料中蔗糖浓度进行检测，发现可口可乐零度含有痕量蔗糖，可口可乐、百事可乐以及红牛中蔗糖含量在配料表标注的范围内，而以绿茶为代