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1、银杏叶提取物对百草枯致PC12细胞损伤的保护作用及机制论文康小刚，陈建宗，王百忍，徐震，李海龙，奚淑芳【关键词】银杏叶提取物NeuroprotectiveeffectsofginkgobilobaextractagainstparaquatinducedPC12celllinedamageanditsmechanism【Abstract】AIM:Tostudytheneuroprotectiveeffectandrelatedmechanismsofginkgobilobaextract(EGB761)againstparaquat(PQ)inducedapoptosisinph
2、eochromocytoma(PC12)cells.METHODS:UsingPQinducedPC12cellsdamageasthemodelofParkinsonsdiseaseinvitro,thecytotoxicityofPQeasuredby3［4,5dimethylthiazol2yl］2,5diphenyltetrazoliumbromide(MTT)assay,theimpairmentofPC12cellsetryandthemorphologicalchangeofPC12cellsmunocytochemicalstaining.RESULTS:40mg
3、/LEGB761playedaprotectiveroleinthedamageinducedby300μmol/LPQfor24h.EGB761significantlyinhibitedLDHreleaseinducedbyPQinPC12cells（0.25±0.01）(P0.05vsPQgroup).EGB761decreasedtherateofapoptosisto17.1%andtheoverexpressionofcaspase3inducedbyPQinPC12cells.CONCLUSION:EGB761canprotectcellsfromthenecros
4、isandapoptosisinducedbyPQ,ayberelatedtotheinhibitionofcaspase3proteaseactivation.【Keyg/LEGB761对300μmol/LPQ作用于PC12细胞24h，具有一定的保护作用；EGB761可明显抑制PQ诱导的PC12细胞LDH的释放（0.25±0.01）(与PQ组比较.freela公司产品；DMEM培养液、胎牛血清、马血清为Gibco公司产品；乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒为南京建成生物工程研究所产品；兔抗鼠Caspase3抗体为北京中山公司产品.倒置相差显微镜：德国LEICA公司；CO2孵箱：SANY
5、O公司；酶联免疫检测仪：DYNATECH公司；流式细胞仪：美国BECKMANCOULER公司.1.2方法1.2.1PC12细胞的培养PC12细胞是大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株，购于日本.培养于100mL/L马血清、50mL/L胎牛血清的DMEM培养液中，于37℃,50mL/LCO2条件下培养，每2～3d换液1次.细胞80%融合时，用1.25g/L胰酶消化，1∶3分瓶传代.选取对数生长期细胞进行实验处理.1.2.2药物处理根据MTT比色试验筛选的PQ浓度及作用时间和EGB761保护浓度，实验分正常对照组、损伤组、保护组.正常对照组不加药，损伤组只加PQ，保护组加入EGB7612h后再
6、加PQ，各组均在加药24h后进行检测.1.2.3MTT比色法检测细胞活性细胞以2×107/L接种于96孔板，设0,50,.freelol/LPQ组，每组设4个复孔.筛选出实验处理浓度.以所选PQ浓度为终浓度处理细胞，设正常对照组及4,8,12,24,48,72h损伤组，每组设4个复孔.筛选出损伤作用时间.继之进行以下实验.设正常对照组，损伤组及1,10,20,40,60,80,100mg/LEGB761保护组，保护组在加入EGB7612h后再加PQ，每组设4个复孔.终止培养前4h每孔加入MTT溶液20μL，置37℃继续培养4h.弃上清，每孔加入DMSO150μL，振荡10min使
7、蓝色结晶充分溶解，上酶标仪以波长560nm检测每孔吸光度值（A值）.1.2.4LDH释放的测定LDH能催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸与2，4二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中呈棕红色，通过比色可求出酶活力.药物处理后，每样品收集培养上清20μL，加入基质缓冲液250μL、辅酶I50μL，混匀，37℃水浴15min；再加入2，4二硝基苯肼250μL，混匀，37℃水浴15min；加入0.4mol/LNaOH2.5mL，混匀，室温放置3min，上酶标仪以波长440nm检测每孔
