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1、探讨LA对百草枯中毒的心肌损伤的保护机制 百草枯(paraquat,PQ),又名克芜踪,是全世界目前使用广泛的有机杂环类接触性脱叶剂及除草剂,对人畜具有较强毒性,可经皮肤、呼吸道和消化道等3种途径进入体内,产生多系统毒性。我国作为农业大国,百草枯中毒患者呈现不断上升趋势,临床死亡率高达60%~80%,目前对于百草枯中毒仍缺乏特异性的治疗。硫辛酸(Lipoic Acid,LA)1951年由Reel首次从猪肝中分离出来,是参与三羧酸循环过程中不可缺少的物质,硫辛酸在脂溶性及水溶性环境下都可以溶解,其脂溶性可使它在减少细胞膜上的自由基,如清除脂质过氧化物;其水溶性则使它能够与细胞液接触,有效
2、地清除源于线粒体的自由基。 LA能抑制NF-КB活化,减少炎症细胞释放IL-1β、TNF-α;此外,LA可抑制脂多糖诱导的动脉内皮细胞,心内膜内皮细胞Fractal kine的表达及CX3CR1阳性细胞对活体内血管、心肌的浸润,改善心肌功能紊乱。本研究旨在通过观察LA对百草枯中毒后细胞因子水平的变化,来探讨LA对百草枯中毒的心肌损伤的可能保护机制。 1、材料与方法 1.1实验动物 购买健康雄性Sprage-Dan;20g。将SD大鼠随机分为正常对照组(NS)、百草枯中毒组(PQ)、百草枯+还原型谷胱甘肽组(GSH)、百草枯+硫辛酸治疗组(LA)。NS组6只,
3、PQ组和GSH组各24只;LA组72只,再细分为3个亚组,即30mg/kg、60mg/kg、100mg/kg亚组,每亚组24只。 1.2实验试剂 百草枯(商品名:克无踪,20%水剂)。硫辛酸注射液:药品规格:20ml:0.6g2支。还原型谷胱甘肽注射液:药品规格:0.6g(粉剂)。 NF-κB、NOS、NO、CK、CKMB、LDH、AST试剂盒,购置于武汉新启迪生物科技有限公司(进口分装)。 1.3模型制备及给药方法 NS组给予等量的生理盐水灌胃;PQ组给予PQ50mg/kg一次性灌胃染毒;GSH组给予PQ50mg/kg一次性灌胃,半小时后给予GSH200mg/kg
4、腹腔注射给药,GSH组造模后每天同一时间再重复给药一次;LA组在给予PQ50mg/kg一次性灌胃,半小时后分亚组给予LA30mg/kg、60mg/kg、100mg/kg腹腔注射给药,LA组造模后每天同一时间再重复给药一次。 NS组取材就指定在注射生理盐水造模后第7d取材,PQ组、GSH组和LA组取材是在模型成功后的1、3、5、7d。所有大鼠在氯胺酮麻醉下解剖,沿胸骨中线切开暴露胸腔,腹主动脉取血,结扎心脏血管,将心脏取出。 1.4样本收集及观察指标 将心肌标本沿纵轴一分为二,左半部分以10%中性福尔马林溶液固定,送病理科石蜡包埋、切片及HE染色,普通光镜下观察其病理变化。右半部分以
5、冰冷生理盐水清洗后,置于-80℃冰箱中保存以备后续的NF-κB、NOS、NO水平测定。血清-用干净试管收集血液,室温凝固2h,离心1000g10min,收集血清,分装后-80℃冷冻保存。 ELISA法检测AST、LDH、CK、CK-MB水平,严格按照试剂和说明书操作。 心肌组织匀浆上清的制备:采集心肌组织,在冰冷的生理盐水中漂洗,除去血液,滤纸拭干,称重,剔除附属的结缔组织,称取组织块。用移液管量取0.1MPBS,匀浆介质或生理盐水的体积总量应该是组织块重量的9倍,用眼科小剪尽快剪碎组织块。机器匀浆:用组织捣碎机10000~15000r/min上下研磨制成10%组织匀浆,
6、也可用内切式组织匀浆机制备(匀浆时间20秒/次,间隙30秒,连续3~5次,在冰水中进行)。将制备好的10%匀浆用离心机4℃,3000r/min离心15min,将离心好的匀浆留上清,弃下面沉淀。取上清。分装-80℃冻存备用。ELISA法检测心肌组织内NOS、NO、NF-κB水平,严格按照试剂和说明书操作。 1.5统计学方法 采用SPSS17.0统计软件对结果进行方差(ANOVA)分析、LSD-t检验和SNK-q检验,组间和组内数据采用方差齐性检验后,进行LSD-t检验和SNK-q检验比较,所有数据用珚x±s表示,以P<0.05或P<0.01为差异有
7、统计学意义。 2、结果 心肌组织病理检查(见表1)。NS组心肌组织结构完整,未见出血、水肿、坏死。而LA组在进行干预后的组织学出现上述改变较PQ组少,心肌组织损伤较PQ组及GSH组轻。 2.1NF-κB水平,NOS、NO活力NF-κB水平,NOS、NO活力见表2~4。 2.2心肌酶谱水平。用ELISA法测出腹主动脉血中心肌酶谱的水平,得出数据我们看出LA组相同时点均比PQ组及GSH组低,P<0.
