arhi基因对卵巢癌细胞作用及作用体制研究

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1、ARHI基因对卵巢癌细胞作用及作用体制研究第一章引言卵巢恶性肿瘤的发病率，占女性常见恶性肿瘤的2.4％～5.6％，60％～70％就诊时病灶已属晚期。采用常规的治疗手段（以手术为主，加用化疗、放疗的综合治疗），其五年生存率仅徘徊在30％左右[1]。因此在手术和放化疗改善晚期卵巢恶性肿瘤患者的近期治疗效果的基础上，寻求新的治疗方案及预防复发显得非常重要，近年来研究抑癌基因及应用抑癌基因治疗卵巢癌已成为一大热点。肿瘤的发生是一个多因素、多步骤参与的复杂的生物学过程，涉及到多个癌基因的激活和抑癌基因的失活。关于各种癌基因和抑

2、癌基因在卵巢肿瘤发生发展中的作用和作用机制的研究目前仍是零散和有限的，已知卵巢癌中有p21、ras、C-myc、p53、p27、p16、RB、BRCA1等基因变化的发生与卵巢癌的发生有关[1]。其它的癌基因和抑癌基因是否参与卵巢癌的发生发展，具体作用机制如何，众多与卵巢癌发生发展相关的基因之间的相互作用，以及这些基因表达产物与卵巢癌的临床病理相关性怎样，如何对卵巢癌患者根据基因改变及基因表达产物进行个体化治疗等等均有待进一步的研究。母源性肿瘤抑制印迹基因ARHI(aplasiaRashomologmemberI，也称

3、DIRAS3、NOEY2)定位于人染色体1p31，大约8kb，其中包括两个外显子，一个内含子，ARHImRNA的3末端有4个AU-富集区域[2]。在ARHI基因中包括了三个CpG岛，其中第一个CpG岛位于该基因的启动子区域，第二个CpG岛跨越了启动子和第一个外显子区，第三个CpG岛处于第二个外显子之内[3]。沈文洁等研究发现除了细胞胚胎未见表达外，卵子和其余各期胚胎均可测得ARHI基因表达，证实抑癌印迹基因ARHI在种植前胚胎中有表达[4]。ARHI在心、肝、胰、脑等正常人组织均有一定表达，正常卵巢中存在较高表达，但

4、它在63％～67％的卵巢癌中ARHI表达丢失或明显下调[5]。有研究表明ARHI抑制细胞生长，细胞中ARHI失表达有助于卵巢癌的形成[6]。ARHI在肿瘤中异常表达的可能机制有甲基化异常、杂合子丢失及乙酰化组蛋白水平低表达等[7-9]。利用去甲基化因子和组蛋白去乙酰化酶抑制剂作用于不同组织促使ARHI基因再表达，结果显示肿瘤生长速度降低、细胞凋亡加速[10]。还有研究表明ARHI在上皮性卵巢癌中持续表达与延长无瘤生存期及细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p21(athiasT等[14]的研究也表明自体吞噬可导致细胞死亡。

5、LC3可视为自噬的标志物，人类的LC3分为两型：LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ，在自噬发生时LC3-Ⅰ在泛素样系统包括Apg7和Apg3的调解下转化成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ结合并始终位于胞内自噬体的膜上，其含量的多少与自噬泡数量的多少成正比。因此LC3-Ⅱ的表达强度与自噬活性密切相关，可用其来检测自噬的发生。研究证明STAT3是一个潜伏在细胞浆中的转录因子[15]，目前已被公认为癌基因，它的磷酸化需要酪氨酸激酶参与，例如Janus酪氨酸激酶(Janustyrosinekinases,Jaks)。Jaks和细胞因子受体和G蛋白

6、偶联受体相关联形成受体酪氨酸激酶，例如表皮生长受体和血小板衍生的生长因子受体酪氨酸激酶[16]。DuanZ等研究发现STAT3信号转导通路在卵巢癌发生过程中起重要作用[17]。STAT3作为上游酪氨酸激酶，通过调控靶基因而诱导某些关键产物的表达来影响卵巢肿瘤的发生，重要的靶基因产物包括CyclinD1与Caspase家族成员。细胞周期素D1(CyclinD1)在细胞周期的调控中起重要作用，通常与细胞周期素依赖性激酶CDK4或CDK6结合，控制由G1期进入S期的过程。P-STAT3高表达卵巢癌细胞系中CyclinD1表

7、达增高，而P-STAT3低表达细胞系中CyclinD1表达下降。..第二章材料和方法1．材料质粒pcDNA3.0-ARHI和质粒pIRES2-EGFP由美国德克萨斯大学安德森癌症中心惠赠，这两种质粒为实验研究中常用载体，其结构如图1.1。质粒pIRES2-EGFP具有加强型绿色荧光蛋白（Enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP）表达标签，此用来指示转录效率，该质粒含有卡那霉素（kan）和新霉素（Neo）两种抗性基因，故可分别用于原核（kan）和真核（G418）筛选。这两种质粒宽阔的多克

8、隆位点区（MCS）中包括了众多的酶切位点，是后续酶切鉴定的基础，本研究选用BamHI和EcoRI双酶切。克隆用E.coli单菌落由江苏省血液研究所惠赠。人卵巢癌SKOV3细胞、HOSE细胞、A2780细胞、HO8910细胞、HO8910PM细胞、CAOV3细胞、ES2细胞、OVCAR3细胞、3AO细胞九株细胞系均购自中国科学院上海生命科学研究院