哮喘大鼠孤束核内h3受体对呼吸道 p物质样免疫反应物的影响论文

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1、哮喘大鼠孤束核内H3受体对呼吸道P物质样免疫反应物的影响论文【摘要】目的：探讨大鼠孤束核(NTS)内组胺H3受体对哮喘发作时呼吸道内神经源性炎症介质P物质（SP）含量的影响。方法：取健康雄性SD大鼠成功制备哮喘模型后诱发哮喘急性发作，采用中枢立体定位及核团微量注射技术，分组依次向NTS内微量注射无菌生理盐水、H3受体激动剂RMHA以及其拮抗剂Thio，利用肺内SP特异性抗血清、免疫组化法（SABC法）、葡萄糖氧化酶DAB镍染色和计算机图像分析等技术检测肺内SP的含量。结果：和对照组相比较，哮喘大鼠NTS内微量注射1μgRMHA，肺内SP样免疫反应物（SPR

2、IL）阳性数量显著减少、阳性密度降低，差异有显著统计学意义（P＜0.01）；如果在哮喘大鼠NTS内注射Thio5μg，则可拮抗RMHA的上述效应。结论：大鼠NTS内H3受体参与减少哮喘发作时神经源性炎症介质SP的释放.freelg、氢氧化铝干粉100mg、灭活百日咳杆菌5×109个配成的混悬液1ml1次，自第15天开始用超声雾化器雾化吸入1%OVA生理盐水溶液（2～3ml·min-1，颗粒直径≤5μm），每天1次，每次均以哮喘症状出现（烦躁不安、呼吸急促、用力呼吸、呼吸困难、喘息、腹肌明显收缩、咳嗽等）作为指标，连续3d。NS组大鼠在致敏和吸入激发阶段均以生

3、理盐水代替OVA混悬液，吸入时间为同批哮喘模型组鼠最长诱喘时间。1.2核团定位和给药方法模型大鼠乌拉坦（1g·kg-1，ip）麻醉后，将鼠头固定于立体定位仪上，参照PaxinonsHA，Sigma公司)临用前用无菌生理盐水配制成1、2μg·μl-1；组胺H3受体拮抗剂thioperamide(Thio,Sigma公司)用无菌生理盐水新鲜配制成10μg·μl-1，pH7.2～7.4，低温保存，注射前置于37℃水浴箱中加温。实验结束后用相同给药法在原点注射等体积美蓝后，将大鼠头浸泡在10%的甲醛液内，7d后冰冻切大鼠脑片(40μm)，查找注射点，对照大鼠脑图谱确

4、定注射部位，凡未打中NTS的实验动物均剔除。1.3实验分组将已成功制备的哮喘模型大鼠按NTS处注射不同药物再随机分为哮喘组（OVA+NS组）、OVA+RMHA组、OVA+Thio组3组，每组6只，3组在静脉注射OVA溶液（40mg·kg-1，共0.1ml）诱发哮喘急性发作后，依次往NTS内微量注射1μl无菌生理盐水、1μgRMHA、5μgThio，给药体积均为1μl。另外NS组于静脉注射0.1ml无菌生理盐水后，NTS内微量注射1μl无菌生理盐水。1.4组织标本制作各组大鼠于静脉注射OVA激发哮喘急性发作、NTS内微量注射相应药物的10min后打开胸腔，暴露心

5、脏，剪开右心室，将灌注针插入肺动脉，剪开左心耳。先用100～200ml生理盐水快速冲洗血液，直至流出的液体呈无色，然后再用4℃4%的多聚甲醛溶液400ml持续灌注，先快后慢，约2h。灌注完毕后取出支气管和右肺下叶，置4℃4%的多聚甲醛溶液中固定4h，然后放入30%的蔗糖溶液中4℃过夜。1.5免疫组化方法（SABC法）取出组织标本，用冰冻切片机切片，片厚40μm，收集在切片盒中。切片经新鲜配制的0.3%甲醇H2O2溶液处理后，加入兔抗SP血清(1∶400，Sigma公司)，4℃过夜。加入即用型生物素化的羊抗兔血清（Sigma公司），室温反应4h，再加入链霉亲合素

6、生物素过氧化物酶（SABC）复合物（Sigma公司），室温2h。每一步骤前均经0.01mol·L-1的PBS（pH7.4）充分漂洗3次，每次10min。最后以葡萄糖氧化酶DAB硫酸镍铵法显色。常规裱片，系列酒精（75%、95%、无水乙醇）脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。免疫组化染色替代试验：用PBS代替兔抗SP第一抗体，其他实验步骤不变。1.6计算机图像分析使用加拿大Optimas6.2图像分析系统，将待测切片置于连接计算机的显微镜下，彩色显示屏即出现待测切片的图像，用光笔勾画出支气管、细支气管管壁作为参照面积并测出其面积大小。图像处理系统对输入的图像

7、作0～255级交互分割后，黑色为最小值0，白色为最大值255，选定SP样免疫反应阳性物进行灰度扫描，测定其阳性总面积，阳性总面积和参照面积的比值即为阳性密度值。每例动物随机抽取3～4张切片，每张切片随机选取4个视野，每组6只动物间取平均值，即为该组动物SPRIL的阳性密度值。用t检验比较各组间SP样免疫反应物的平均密度值，P＜0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1显微镜观察结果所有免疫反应阴性对照片显色呈阴性反应。各组免疫反应切片上，SP样免疫反应物（SPRIL）被染成棕褐色，主要分布于支气管和细支气管的平滑肌层和上皮层。背景染色为淡黄色，对比鲜明。其

8、中NS组大鼠肺内支气管壁可见稀疏、呈点