离心并贴壁法培养兔骨髓间充质干细胞的成骨特性论文

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1、离心并贴壁法培养兔骨髓间充质干细胞的成骨特性论文张文鹏叶发刚禇言琛【摘要】目的观察密度梯度离心并贴壁培养法体外分离纯化兔骨髓间充质干细胞的效果，以及诱导后的兔骨髓间充质干细胞的成骨特性。方法采用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离兔骨髓间充质干细胞。采用倒置显微镜进行形态学观察、免疫细胞化学法鉴定骨髓间充质干细胞膜抗原；经成骨培养液诱导培养后，对碱性磷酸酶活性、细胞矿化形成钙化结节的能力进行测定。结果分离的骨髓间充质干细胞24h后贴壁，贴壁细胞平均10d形成克隆，细胞表型稳定。诱导条件下，细胞碱性磷酸酶活性明显增高，Von.Kossa染色可见矿化结节。结论密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分

2、离纯化兔骨髓间充质干细胞，用此种方法培养的细胞具有骨髓间充质干细胞的一般生物学特性。【关键词】骨髓；间质干细胞；细胞培养技术；成骨分化；兔［ABSTRACT］ObjectiveToobservetheeffectofin-vitroisolationandpurificationofrabbitbonemarroesenchymalstemcells（rBMSCs）bydensitygradientcentrifugation（DGC）andattachmentculture,andtheosteogeniccharacteristicsofinducedrBMSCs.Methodsr

3、BMSCsicroscopically.rBMSCsmembraneantigensmunocytochemicaltechnique.AftertherBMSCsedium,theactivityofthealkalinephosphatase（ALP）andabilitytoformmineralizednodusined.ResultsTheisolatedrBMSCsbegantoadhereafterculturedfor24hours,theattachedrBMSCsbegantoformcloneataverageof10daysandthephenotypeofrBM

4、SCsentmethodcaneffectivelyisolateandpurifyrBMSCs.ThecellsculturedicsofBMSCs.［KEYSCs）具有较强的增殖活性。研究表明.freela公司），大鼠抗兔CD34-FITC、CD29-FITC（北京中山生物公司）。1.1.3成骨诱导液包含基础培养液（内含体积分数0.10胎牛血清、低糖DMEM、100U/L青霉素、100U/L链霉素），10mmol/L的β-甘油磷酸钠，10-7mol/L地塞米松，50mg/L维生素C。1.2方法1.2.1BMSCs分离和培养兔用30g/L戊巴比妥钠耳缘静脉麻醉，髂后上嵴处备皮。无菌术

5、抽取肝素抗凝骨髓约5mL，加入5mL的L-DMEM培养液混匀，以1000r/min离心5min，弃去上清液。以5mLL-DMEM培养液重悬细胞。将1.077kg/LPercoll分离液先置于试管的底部,然后按照1∶1的比例缓慢滴加稀释后的骨髓，以2500r/min离心30min,收获界面层的单核细胞。将其重悬于含体积分数0.10胎牛血清的L-DMEM培养液中，接种于25cm2培养瓶内,浓度1.0×108/L,置于37℃、体积分数0.05CO2培养箱内孵育，每2～3d换1次液。待细胞生长至瓶底90%汇合时,进行传代。然后取第3代细胞进行成骨诱导培养，实验组加入诱导分化培养液，对照组加入等

6、量基础培养液，每3d换液1次。1.2.2细胞观察倒置相差显微镜观察体外培养细胞的生长、增殖及细胞形态的变化情况。1.2.3BMSCs生长曲线绘制取1、3、5、7代兔BMSCs，消化，加入L-DMEM完全培养液，接种于24孔培养板中，作相应标记（P1、P3、P5、P7）。细胞计数，计算均值，连续9d。MicrosoftExcelXP软件绘制细胞生长曲线。1.2.4BMSCs表面抗原分析第3代细胞消化、计数、离心，加入200μLPBS制成细胞悬液。设置阴性对照，加入大鼠IgG1-FITC，其他管加入大鼠抗兔CD34-FITC、CD29-FITC，细胞与荧光素-共轭抗体抗CD29、CD34，

7、在黑暗中孵化15min。流式细胞仪检测。1.2.5碱性磷酸酶及矿化结节染色检查成骨诱导14d细胞爬片，在40g/L多聚甲醛溶液中固定10～15min后，用Gomori钙-钴法进行碱性磷酸酶染色检查［3］。成骨诱导21d细胞爬片后，行Von.Kossa染色检查。2结果2.1细胞形态学观察原代培养12h后大部分细胞贴壁，细胞呈小多角形、梭形。9～10d细胞互相融合达90%左右，此时细胞排列呈较均一的螺旋状或旋涡状（图1）。传代细胞呈小多角形、长梭形