离心并贴壁法培养兔骨髓间充质干细胞的成骨特性

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1、离心并贴壁法培养兔骨髓间充质干细胞的成骨特性：张文鹏叶发刚禇言琛【摘要】目的观察密度梯度离心并贴壁培养法体外分离纯化兔骨髓间充质干细胞的效果，以及诱导后的兔骨髓间充质干细胞的成骨特性。方法采用密度梯度离心法结合贴壁培养法分离兔骨髓间充质干细胞。采用倒置显微镜进行形态学观察、免疫细胞化学法鉴定骨髓间充质干细胞膜抗原；经成骨培养液诱导培养后，对碱性磷酸酶活性、细胞矿化形成钙化结节的能力进行测定。结果分离的骨髓间充质干细胞24h后贴壁，贴壁细胞平均10d形成克隆，细胞表型稳定。诱导条件下，细胞碱性磷酸酶活性明显

2、增高，Von.Kossa染色可见矿化结节。结论密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化兔骨髓间充质干细胞，用此种方法培养的细胞具有骨髓间充质干细胞的一般生物学特性。【关键词】骨髓；间质干细胞；细胞培养技术；成骨分化；兔　　［ABSTRACT］ObjectiveToobservetheeffectofin-vitroisolationandpurificationofrabbitbonemarroesenchymalstemcells（rBMSCs）bydensitygradientcentrifugati

3、on（DGC）andattachmentculture,andtheosteogeniccharacteristicsofinducedrBMSCs.MethodsrBMSCsicroscopically.rBMSCsmembraneantigensmunocytochemicaltechnique.AftertherBMSCsedium,theactivityofthealkalinephosphatase（ALP）andabilitytoformmineralizednodusined.Results

4、TheisolatedrBMSCsbegantoadhereafterculturedfor24hours,theattachedrBMSCsbegantoformcloneataverageof10daysandthephenotypeofrBMSCsentmethodcaneffectivelyisolateandpurifyrBMSCs.ThecellsculturedicsofBMSCs.　　［KEYSCs）具有较强的增殖活性。研究表明，BMSCs具有向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、神经元细胞等

5、多种组织细胞分化的能力［1，2］，因而其在组织工程、细胞工程领域潜在的应用价值越来越受到人们重视。本研究采用密度梯度离心法分离BMSCs，结合贴壁培养法进行培养，并用诱导分化培养液做定向诱导培养，观察BMSCs向成骨细胞分化过程中的细胞形态学变化，进行成骨细胞生物学表型鉴定，以探讨BMSCs的培养方法、生长规律及向成骨细胞分化的特性。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1实验动物　　2月龄新西兰纯种大耳白兔，由青岛市实验动物中心提供。　　1.1.2试剂　　Percoll分离液（天津灏洋生物制品公司）

6、，DMEM培养基（Gibco公司）、胰酶（Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青生物公司）,地塞米松、β-磷酸甘油、抗坏血酸（Sigma公司），大鼠抗兔CD34-FITC、CD29-FITC（北京中山生物公司）。　　1.1.3成骨诱导液　　包含基础培养液（内含体积分数0.10胎牛血清、低糖DMEM、100U/L青霉素、100U/L链霉素），10mmol/L的β-甘油磷酸钠，10-7mol/L地塞米松，50mg/L维生素C。　　1.2方法　　1.2.1BMSCs分离和培养　　兔用30g/L戊巴比妥钠耳缘静脉

7、麻醉，髂后上嵴处备皮。无菌术抽取肝素抗凝骨髓约5mL，加入5mL的L-DMEM培养液混匀，以1000r/min离心5min，弃去上清液。　　以5mLL-DMEM培养液重悬细胞。将1.077kg/LPercoll分离液先置于试管的底部,然后按照1∶1的比例缓慢滴加稀释后的骨髓，以2500r/min离心30min,收获界面层的单核细胞。将其重悬于含体积分数0.10胎牛血清的L-DMEM培养液中，接种于25cm2培养瓶内,浓度1.0×108/L,置于37℃、体积分数0.05CO2培养箱内孵育，每2～3d换1次液

8、。待细胞生长至瓶底90%汇合时,进行传代。然后取第3代细胞进行成骨诱导培养，实验组加入诱导分化培养液，对照组加入等量基础培养液，每3d换液1次。　　1.2.2细胞观察　　倒置相差显微镜观察体外培养细胞的生长、增殖及细胞形态的变化情况。　　1.2.3BMSCs生长曲线绘制　　取1、3、5、7代兔BMSCs，消化，加入L-DMEM完全培养液，接种于24孔培养板中，作相应标记（P1、P3、P5、P7）。细胞计数，计算均值，连续9d。