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1、甲状腺功能亢进肝阳上亢证大鼠下丘脑组织蛋白质差异表达的观察论文.freelusintheHyperthyroidismRatsemethod,byobservingdifferencesonproteinexpressionofhypothalamusinthehyperthyroidismratsalrats,tosearchthedifferentialprotein.MethodsModelsofanimalodelgroupandtreatedgroupbyproteintechnique.ResultsProteinsa
2、inlydisplayedatrangeofpI3～8,Mr(14.4～75)kD.18proteinincreasedand24proteindecreasedinmodelgroupparedinalhydrolaseisozymeL1,Platelet-activatingfactoracetylhydrolaseIBgammasubunit,glutamatedehydrogenase,dihydropyrimidinase-relatedprotein2,NSFL1cofactorp47,Tubulinbeta5.Con
3、clusionThereayberelatedin,煎煮2次后再将药液合并,浓缩为含原药材0.2g/mL。1.3试剂2-DQuantKit蛋白质定量试剂盒、固相pH梯度干胶条(IPGstrippH3-10L,24cm)、IPG缓冲液(pH3-10L)、覆盖液均由AmershanBiosciences公司提供；二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、尿素(urea)、甘氨酸、Tris、CHAPS、SDS、考马斯亮蓝、琼脂糖均由Sigma公司提供；低分子量标准蛋白质由上海伯奥生物制品公司提供；硫酸氨、磷酸、无水甲醇、无
4、水乙醇均由湖南师范大学试剂厂提供。1.4仪器EttanIPGphorⅡ等电聚焦仪,EttanDALTⅡSystem垂直电泳槽(Amersham公司),Imagescanner扫描仪(Sigma公司),PDQest7.0分析软件(Bio-Rad公司),Elx800自动酶标仪(Bil-TekInstru-ments,Inc),AppliedBiosystemsVoyager-DESTRBiospectrometryTM4307MALDI-TOF-MS质谱仪(ABI公司提供)。2实验方法2.1甲亢肝阳上亢证模型的复制将大鼠随机分为正常组
5、和模型组(各10只)。正常组不做任何处理,每天进行正常饮食。模型组参照文献3-4方法,予附子汤,10mL/(kg·d)灌胃,相当于原药材2g/(kg·d),共3周,第11天开始将左甲状腺素钠(L-T4)1mg/(kg·d)体重灌胃,连续10d,造成甲亢肝阳上亢证大鼠模型。模型复制成功的标准参照鄢氏等3的方法,包括一般情况和用放射免疫法测T3、T4；其中一般情况有大鼠的外观、性情变化、肛温和饮水量的变化(于造模前、后各观察1次)。2.2标本的准备所有动物在处死前均从腹腔注射麻醉剂(10%水合氯醛,2mg/kg),待动物麻醉后在洁净的
6、冰台上取出下丘脑。迅速将下丘脑用冰生理盐水冲洗干净,装在标记好的冻存管中液氮保存备用。2.3组织蛋白质的提取及浓度测定将处理过的标本从液氮罐中取出,置于研磨管,加入组织裂解液0.2mL(7mol/L尿素,2mol/L硫脲,2%NP-40,1%TritonX-100,100mmol/LDTT,5mmol/LPMSF,4%CHAPS,0.5mmol/LEDTA,40mmol/LTris,2%pharmalyte)研磨,静置1h,12000r/min4℃离心60min,取5μL上清用于2-DQuantKit蛋白质定量试剂盒的微量测试法测
7、定总蛋白质浓度,其余上清液冻存于-80℃备用。2.4固相pH梯度双向凝胶电泳和考马斯亮蓝染色①第一向固相pH梯度等电聚焦EPG-DALT,按IPGphorTM等电聚焦系统指南进行。组织总蛋白质提取物(含蛋白质800μg)与水化液及IPG缓冲液pH3～10,2.25μL充分混合,总体积450μL,加入IPG持胶槽,将IPG干胶条去保护膜胶面朝下,置入持胶槽中,覆盖一层矿物油,盖好持胶槽盖子,置于IPGphor等电聚焦仪的电极板上。水化和聚焦在20℃自动进行,总电压时间积为70020Vh,其中水化在30V低电压进行14h,然后经过10
8、0V1h,500V1h,1000V1h,最后稳定在8000V下进行。②平衡：等电聚焦结束后,迅速取出带样品的IPG胶条,分别于20mL平衡液A和平衡液B中各平衡15min。③第二向垂直板SDS-PAGE电泳：将平衡后IPG的胶条移至0.75mm厚的
