猪视网膜神经节细胞的培养及超微结构论文

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1、猪视网膜神经节细胞的培养及超微结构论文.freelethodforretinalganglioncells（RGCs）andtoinvestigatereciprocityamonginhomogeneitycellsofretinainordertolayafoundationfortheexperimentalresearchinvitro.METHODSRetinalcellsixtureandretinalganglioncellsinpu-rification，toobservethes

2、tateofganglioncellsanditsaxon.RESULTSRetinalganglioncellsthatculturedinmix-turegreeofcellsaliveshortened.CON┐CLUSIONCulturingretinalcellsinmixturebenefitsthepasteandgroa），DMEM培养基（Gibco公司）;小牛血清（杭州四季青生物工程公司）;YJ-875医用净化工作台（苏州净化仪器厂）;TE-HER式数字式CO2培养器（日本平泽制

3、造厂）;其它试剂均为分析纯.1.2方法1.2.1视网膜细胞混合培养选用屠宰场宰杀后的猪立即摘取眼球，剪除周围结缔组织，清水充分洗涤，2000uL-1的庆大霉素浸泡20min，移入超净工作台，沿眼球赤道部环形切开眼球，去除晶体及玻璃体，轻轻剥离视网膜感觉层，剪碎后加入2.5gL-1胰酶消化30min，加入1mLDMEM-10mLL-1小牛血清终止消化，以吸管吹打使之成单细胞悬液，离心洗涤，计数后以1×106mL-1细胞密度接种于培养瓶中，37℃，50mLL-1CO2孵箱培养.1.2.2视网膜神经节细

4、胞纯化培养眼球处理方法同上所述，将剪碎的视网膜组织置于含牛血清白蛋白（0.2gL-1）、DL-半胱氨酸（0.2gL-1）、木瓜蛋白酶（433.42mmolL-1s-1）的Hanks液中，于37℃消化40min［3］.离心洗涤后接种培养.细胞贴壁后，以细胞擦去除残余胶质细胞，继续培养观察.1.3RGCs鉴定1.3.1倒置显微镜观察以倒置显微镜观察细胞形态，并于细胞培养24，48h时，在倒置显微镜下用目镜测微尺测量神经节突起生长的长度.测量时在高倍镜下选取突起可完全与其它细胞突起区别的神经节细胞，每次

5、测量选取10个.1.3.2电子显微镜观察贴壁细胞经木瓜蛋白酶消化后，以平衡盐溶液洗涤2次，30mLL-1戊二醛固定细胞24h，10gL-1锇酸后固定30min，丙酮脱水，环氧树脂618包埋，超薄切片，用醋酸铅-枸橼酸铅双染后，JEN-2000EX型透射电镜观察.1.3.3免疫组织化学将贴壁生长的细胞用40gL-1多聚甲醛固定，抗神经元特异性烯醇化酶（NSE）常规免疫组化染色.2结果2.1光镜观察2.1.1视网膜细胞混合培养接种后24h时悬浮细胞较多，少数细胞贴壁，细胞呈圆形，部分贴壁细胞可见突起（

6、Fig1）.培养2d时，突起伸长，可见少量梭形的双极细胞.培养6d以后，可见视网膜细胞突起间相互接触，各神经细胞之间形成网络状结构，建立起非常广泛的联系（Fig2）.其中细胞可分为两类:①细胞体积较小，折光性强，伸出细长突起，抗NSE免疫组化染色阳性（Fig3），确认为神经节细胞;②细胞边界不明显，折光性差，排列紧密，分裂增殖旺盛，从形态学上判断为星形胶质细胞.继续培养2和（49.7±14.5）μm，无明显差别，但继续培养至第6天，混合培养组细胞轴突长度为（101.6±18.1）μm，较4d前明显

7、延长（P0.01），纯化培养组细胞轴突长度为（45.2±24.6）μm，较4d前未见明显增长.10d以后，混合培养的细胞生长良好，纯化培养的细胞轴突缩短或消失，可见细胞内出现空泡或细胞漂浮.3讨论3.1视网膜神经节细胞培养方法建立视神经、视网膜属于中枢神经系统的一部分.视网膜神经节细胞的损伤常引起不可逆性视力丧失，探讨视网膜神经节细胞损伤的细胞学和分子生物学机制及如何促进细胞轴突的再生，是临床和基础研究共同关注的热点.RGCs培养可为体外研究神经节细胞的损伤及其恢复提供最直接的实验手段.我们采用视

8、网膜细胞消化分散培养，此法操作简便，有利于观察视网膜不同类型的细胞形态及相互作用.我们观察到培养的视网膜细胞有两类:①有细长突起伸出的小圆细胞;②增殖旺盛的扁平细胞.小圆细胞及其突起抗NSE染色阳性，确认为RGC.Melvin曾描述了类似形态的细胞［4］，确认其为视网膜神经节细胞，他同时还指出分裂迅速的扁平细胞为Muller细胞或星形胶质细胞.电镜观察显示，神经节细胞核较大，胞质少，内含大量的线粒体，说明神经节细胞的氧化磷酸化过程和能量代谢非常活跃，与中枢神经系统的结构特点非常相似