猪视网膜神经节细胞的培养及超微结构.doc

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1、猪视网膜神经节细胞的培养及超微结构作者：杨瑞华，陈景元，邓中荣，刘学东，刘秀红【关键词】视网膜神经节细胞关键词：视网膜神经节细胞;细胞培养摘要：冃的建立视网膜神经节细胞(retinalganglioncells,RGCs)的体外培养方法，并研究视网膜不同类型神经细胞之间的相互作用,为RGCs的体外实验研究奠定基础.方法进行猪视网膜细胞混合体外培养和神经节细胞的纯化培养，观察神经节细胞牛长状态及轴突生长情况，研究视网膜不同类型神经细胞之间的相互作用.结果视网膜细胞混合培养时，神经节细胞生长良好，纯化后的神经节细胞

2、间连接减弱，细胞存活时间缩短.结论视网膜细胞混合培养有利于神经节细胞的贴壁和生长.Keywords:retinalganglioncells;cellcultureAbstract:ATMToestablishaculturemethodforretinalganglioncells(RGCs)andtoinvestigatereciprocityamonginhomogeneitycellsofretinainordertolayafoundationfortheexperimentalresearchinv

3、itro.METHODSRetinalcellswereculturedincommixtureandretinalganglioncellsinpu-rification,toobservethestateofganglioncellsanditsaxon.RESULTSRetinalganglioncellsthatculturedincominix-turegrewverywell.TheconnectsofpurifiedganglioncelIswereweakened,andthetimeofcel

4、lsaliveshortened.COM-]CLUSIONCulturingretinalcellsincommixturebenefitsthepasteandgrowthofganglioncells.0引言自Raff等［1］采用完全消化法于体外成功地培养了生后2〜3d大鼠视网膜神经节细胞（retinalgan-glioncells,RGCs）以来，许多学者曾先后对其进行过研究，视网膜细胞培养常采用组织块体外培养法，用无血清培养液在高浓度氧环境下孵育［2］,但视网膜组织块培养难以观察神经元与胶质细胞间的相互

5、作用，而且无血清培养液价格十分昂贵.因此，寻求一种简便易行的视网膜神经细胞培养方法，对深入探讨视网膜神经细胞损伤的细胞学和分子生物学机制及防护具有十分重要的意义.1材料和方法1.1材料眼球来源于西安市肉联厂；木瓜蛋白酶（中科院上海生化所东风生化技术公司）；牛血清白蛋白（中国医学科学院血液学研究所）；DL-半胱氨酸，Poly-lysin(Sigma),DMEM培养基(Gibco公司)；小牛血清(杭州四季青生物工程公司)；YJ-875医用净化工作台(苏州净化仪器厂);TE-HER式数字式C02培养器(H本平泽制造厂

6、)；其它试剂均为分析纯.1.2方法1.2.1视网膜细胞混合培养选用屠宰场宰杀后的猪立即摘取眼球，剪除周围结缔组织，清水充分洗涤，2000uL-1的庆大霉素浸泡20min,移入超净工作台，沿眼球赤道部环形切开眼球，去除晶体及玻璃体，轻轻剥离视网膜感觉层，剪碎后加入2.5gL-1胰酶消化30min,加入lmLDMEM-lOmLL-1小牛血清终止消化，以吸管吹打使之成单细胞悬液，离心洗涤，计数后以1X106inL-1细胞密度接种于培养瓶中，37°C,50mLL-1C02孵箱培养.1.2.2视网膜神经节细胞纯化培养眼球

7、处理方法同上所述，将剪碎的视网膜组织置于含牛血清白蛋白(0.2gL-1)、DL-半胱氨酸(0.2gL-1)、木瓜蛋白酶(433.42mmolL-1s-1)的Hanks液中，于37°C消化40min[3]•离心洗涤后接种培养•细胞贴壁后，以细胞擦去除残余胶质细胞，继续培养观察.1.3RGCs鉴定1.3.1倒置显微镜观察以倒置显微镜观察细胞形态，并于细胞培养24,48h时，在倒置显微镜下用目镜测微尺测量神经节突起生长的长度•测量时在高倍镜下选取突起可完全与其它细胞突起区别的神经节细胞，每次测量选取10个.1.3.2

8、电子显微镜观察贴壁细胞经木瓜蛋白酚消化后，以平衡盐溶液洗涤2次，30mLL-1戊二醛固定细胞24h,10gL-l娥酸后固定30min,丙酮脱水，环氧树脂618包埋，超薄切片，用醋酸铅-枸椽酸铅双染后，JEN-2000EX型透射电镜观察.1.3.3免疫组织化学将贴壁生长的细胞用4OgL-1多聚甲醛固定，抗神经元特异性烯醇化酶（NSE）常规免疫组化染色.2结果2.1光镜观察2.1.1视网膜