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1、视网膜神经节细胞DiI染色方法王凌妍,刘康,王一,阴正勤（400038重庆，第三军医大学西南医院眼科）[摘要]目的寻求一种简单易行的观察视网膜神经节细胞形态学的染色方法。方法取30d（P30）LongEven's大鼠6只，雌雄不限，麻醉处死,取眼球后剥离完整视网膜，置于4%多聚甲醛溶液中固定12h，取固定视网膜行全视网膜铺片后DiI荧光染色，将视网膜再次置于4%多聚甲醛溶液中避光37℃固定，6d后观察神经节细胞形态。结果染色可见神经节细胞胞体清晰，树突及轴突均匀着色，形态清晰。结论视网膜铺片行DiI染色可以较好的观察神经节细胞形态。[
2、关键词]神经节细胞；视网膜铺片；DiI染色[中图法分类号][文献标志码]A视网膜节细胞(retinalganglioncell,RGC)的形态学特点是研究正常及病理下RGC改变的重要指标[1]。目前对于研究神经节细胞形态学的染色方法有很多种，包括神经逆行染色﹑单细胞染色等，但这些方法步骤繁琐、实验周期长[2,3]，为了得到一种简单易行,重复性高的染色方法，我们采用荧光染料DiI(1,1-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanineperchlorate;Molecularprobe
3、s)行全视网膜铺片染色观察神经节细胞形态,从而寻求一种简单易行的形态学研究方法。1材料与方法1.1材料实验动物选用30d（P30）LongEven's大鼠6只，体质量150～200g，雌雄不限，由第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供。1.2方法1.2.1取材与固定大鼠经腹腔注射注射过量20%乌拉坦处死后，立即取出完整眼球，置于4%多聚甲醛溶液中室温固定30min。取固定后的眼球，剪去角膜并除去晶状体、玻璃体后，仔细分离出完整的视网膜。按图1所示，将视网膜按4个相限剪开，将剪好的视网膜放入4%多聚甲醛溶液中，4℃固定12h
4、。_________________________________[基金项目]国家重点基础研究发展规划资助项目(“973”项目，2007CB512203)[通信作者]王一,E-mail:wangyieye@yahoo.com.cn图1视网膜剪开示意图1.2.2视网膜平铺片DiI染色将固定好的视网膜平铺于干净的载玻片上，并使神经节细胞层向上。用滤纸吸去视网膜周边多余水分后，用干净的注射器针头在4个象限距视乳头3mm处各划一小口并埋入一颗直径约为50μmDiI颗粒。将视网膜浸泡于4%多聚甲醛溶液中，避光37℃固定6d后取出，封片后荧光显
5、微镜观察结果，激光共聚焦显微镜拍照分析。2结果在DiI染色的视网膜平铺片标本上可见神经节细胞层神经节细胞胞体及突触染色清晰，细胞内荧光明亮，细胞突起着色清晰。图2A为荧光显微镜下神经节细胞形态，可见神经节细胞排列紧密,树突分支交织成网，图2B为单个神经节细胞形态，可见神经节细胞胞体及树突着色清晰，其轴突延伸为条索状神经纤维。A：神经节细胞；B：单个神经节细胞图2LE大鼠视网膜神经节细胞DiI染色荧光显微镜下观察结果（×200）图3为激光共聚焦显微镜扫描单个RGC后进行三维重构的细胞图像，图3A为神经节细胞水平面形态，可见RGC胞体及突
6、触形态，分枝清晰可数，可以通过计算机软件对RGC胞体面积及树突分支进行测量计数；图3B为对该细胞进行立体旋转的垂直面形态，可见RGC树突从胞体向外伸展呈伞状。A：神经节细胞水平面形态；B：神经节细胞立体旋转的垂直面形态图3LE大鼠视网膜神经节细胞DiI染色后激光共聚焦结果3讨论DiIC18(3)，全称为1,1-dioctadecyl-3,3,3’,3’-Tetramethylindocarbocyanine，是最常用的细胞膜荧光探针之一，呈现橙红色荧光。DiI是一种亲脂性膜染料，进入细胞膜后可以侧向扩散逐渐使整个细胞的细胞膜被染色。
7、DiI被广泛用于正向或逆向的，活的或固定的神经等细胞或组织的示踪剂或长期示踪剂(long-termtracer)。神经节细胞是视网膜内的三级神经元，位于视网膜最终段的神经细胞，其树突主要与双极细胞联系，也可通过无长突细胞横向联系；其轴突延伸至视神经乳头处,穿过筛板,形成视神经，是视觉传输系统的重要组成部分。本实验采用全视网膜铺片DiI染色观察神经节细胞形态，并对该染色方法的条件进行改进，缩短了染色时间，且方法简单易行，可重复性高。但在染色时染料自身的高荧光会遮挡部分神经节细胞，因此不适用于神经节细胞计数。既往文献报道通常研究视网膜神经
8、节细胞形态学多采用单细胞注射或神经逆行染色后观察神经节细胞形态，但操作较复杂,单细胞染色需要借助膜片钳,操作方法繁琐且耗时长,神经逆行染方法为开颅后将染料注射至上丘或外侧膝状体处,定位较难，且多用于神经节细胞计数研究，固
