缺氧对视网膜m#12539;ller细胞超微结构及gfap表达的影响论文

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1、缺氧对视网膜M#12539;ller细胞超微结构及GFAP表达的影响论文.freelissionelectronmicroscopeandL条件培养基中加20mLConA活化上清液［3］，20mL加强型小牛血清，60mLDMEM/F12培养液，青霉素100UmL-1，庆大霉素10UmL-1.视网膜Müller细胞的制备:将出生5～7d的SD大鼠（由第四军医大学实验动物中心提供）麻醉处死，摘取眼球，移入超净台，在750mLL-1乙醇中浸泡10～20s，用D-Hanks液冲洗数遍，在解剖显微镜下去除眼前节，剥取视网膜

2、.将视网膜剪碎，并用0.5gL-1胰蛋白酶消化10min，Hanks液终止消化，反复吹打细胞制成细胞悬液，经400目筛网过滤，以800rmin-1离心5min，弃上清，用条件培养基调整细胞密度为3×108L-1，接种于塑料培养皿内，于37℃50mLL-1CO2培养箱内培养，24h后换液，以后每3d换液一次，待细胞长至融合以12方式进行传代培养.视网膜Müller细胞的鉴定:预先在培养皿中置入盖玻片，待细胞贴壁融合后，将上述长有3～5代细胞的盖玻片取出，40gL-1多聚甲醛固定30min，30mLL-1H2O2作用

3、15min封闭内源性过氧化物酶，用ABC法进行神经胶质酸性蛋白（glialfibrillaryacidicprotein）染色，DAB显色.1.2缺氧条件的建立将传至3～5代即将融合的Müller细胞随机分为两组，一组为实验组，一组为对照组，实验组置于缺氧（50mLL-1CO2，50mLL-1O2，900mLL-1N2）环境中［4］，给气方式采用持续低流量通气，约50mLmin-1;对照组置于正常（50mLL-1CO2，950mLL-1空气）环境中，培养48h后取出.分别进行超微结构和GFAP表达的测定.1.3超

4、微结构观察即刻收集实验组和对照组细胞，25mLL-1戊二醛预固定，10gL-1锇酸后固定，梯度乙醇脱水，环氧树脂812浸透包埋，超薄切片.枸橼酸铅和醋酸双氧铀双重电子染色，透射电子显微镜观察.1.4GFAP表达观察即刻收集实验组和对照组细胞，每组约1×107个，加入匀浆缓冲液，将细胞置于冰浴中，超声波粉碎，冰浴20min后，13000g离心（4℃，20min）.取上清加入等体积2×SDS-PAGE样品缓冲液，在沸水中煮5～10min使之变性，进行总蛋白定量.将总蛋白量相等的实验组和对照组样品上50gL-1浓缩胶，

5、120gL-1分离胶，行常规SDS-PAGE电泳.取出SDS-PAGE凝胶，将其转移至NC膜上.转移后取出NC膜，浸于丽春红S工作液中1min，去离子水漂洗2次，剪下Marker用考马斯亮蓝染色，其余部分用ABC方法行GFAP染色.显色时待区带清晰，立刻将NC膜浸入去离子水中，终止显色.图1－图5略2结果2.1培养的视网膜Mller细胞生物学特性原代培养的视网膜Müller细胞接种后24h即可贴壁，第一次换液时可将漂浮的及贴壁不牢的细胞洗掉，剩下的细胞则大多数为Müller细胞，同时还混杂有部分神经元细胞.原代细

6、胞生长7～10d即可长满，随后按照12方式传代，传至3代以后即可得到较纯的视网膜Müller细胞.原代培养的细胞胞体较小，连接紧密，多呈不规则形状，折光性暗，镜下可见细胞分成两层，上层细胞胞体小，折光性强，可带有突起.下层细胞胞体大，折光性暗，相互间界限不清.传代后细胞呈单层，胞体变大，折光暗，可见粗大突起.选取3～5代的细胞进行GFAP染色，阳性细胞在90%以上（Fig1）.2.2电镜观察结果对照组视网膜Müller细胞核仁较明显，线粒体狭长，嵴较多，有发达的高尔基体和散在的溶酶体，粗面内质网结构清晰（Fig2

7、）.缺氧组的Müller细胞胞核内异染色质呈斑块状，大部分于核周边凝集，滑面内质网膨大并充满匀质性物质（Fig3）;多数细胞线粒体由狭长形变为圆形，嵴排列疏松（Fig4）;细胞胞质及细胞微绒毛内有大量糖原堆积（Fig5）.2.3ullercellsinculture［J］.GraefesArchClinExpOphthalmol，1997;235（7）:411-414.［2］NeanE，ReichenbachA.TheMüllercell:Afunctionalele-mentoftheretina［J］.Tre

8、ndsNeurosci，1996;19（8）:307-312.［3］PengGH，LiZJ，LiC.ConditionedprimarycultureofretinalMüllercell［J］.YankeYanjiu（ChinOphthalRes），1998;16（1）:13-15.［4］DuHJ，GuoSY，ZhangZM，LuoGD，GouL.Stimulative