骨炎定促进血管内皮细胞增殖的血清药理学研究论文

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1、骨炎定促进血管内皮细胞增殖的血清药理学研究论文曹燕明徐海波张薇陈基长【关键词】骨性关节炎/中药疗法;,.freel、0.2μm双层微孔滤膜过滤除菌，置-40℃低温冰箱保存备用。将购自CCTCC（中国典型培养物保藏中心）的人脐静脉内皮细胞培养至第3～5代，以含体积分数为15%小牛血清的DMEM培养液调成5×107个/L的细胞悬液，100μL/孔接种于96孔培养板中，于37℃、体积分数为5%CO2温箱中饱湿静置培养48h;更换无血清的DMEM培养液，使细胞同步化12h，每孔加入100μL不同时相采集的空白兔血清或骨炎定含药血清，每

2、组均设8个平行孔，总体积为200μL/孔;置37℃、体积分数为5%CO2温箱中饱湿静置培养36h，每孔加入5g/L的四甲基偶氮唑盐（MTT）溶液20μL，继续培养4h以进行显色反应;以体积分数为50%二甲基甲酰胺（DMF）―200g/L十二烷基硫酸钠（SDS）0.1mL终止反应，室温静置过夜;待孔内蓝色结晶完全溶解后置酶标仪上测波长570nm处吸光度（D）。1.3.2血清灭活与否对血管内皮细胞增殖的影响［4-5］按1.3.1方法选取最后1次灌胃给药后2h的兔进行耳中央动脉采血，无菌分离血清，一部分血清经56℃、30min灭活处

3、理;一部分不灭活，经0.45μm、0.2μm双层微孔滤膜过滤除菌，置-40℃低温冰箱保存备用。采用1.3.1方法检测灭活血清和不灭活血清对血管内皮细胞增殖的影响。1.3.3不同剂量的含药血清促进血管内皮细胞增殖的作用［3，5］新西兰兔8只，随机分成空白组和骨炎定低、中、高剂量组，雌雄各半。骨炎定低、中、高剂量组分别以2.5、5、10g/kg灌胃给药，空白组灌胃等容积的蒸馏水，每天2次，早晚各1次（每日药物总量分别相当于60kg成人临床用量的5倍、10倍、20倍），连续7d。于最后1次灌胃后2h兔耳中央动脉采血，无菌分离血清，经

4、0.45μm、0.2μm双层微孔滤膜过滤除菌，置-40℃低温冰箱保存备用。采用1.3.1方法检测不同剂量的含药血清对血管内皮细胞增殖的作用。1.3.4不同作用时间的含药血清促进血管内皮细胞增殖作用的比较采用1.3.1方法检测骨炎定含药血清（10g/kg）作用于血管内皮细胞12、24、36h后的反应。1.4统计学处理数据的统计处理采用SPSS10.0统计软件包，数据先进行方差齐性检验，随后进行方差分析，最后采用Dunt法进行组间比较。2结果2.1不同时相的含药血清促进血管内皮细胞增殖的作用表1结果表明，给新西兰兔每天灌胃2次，早

5、晚各1次，连续7d，于最后1次给药后2h制备的含药血清对血管内皮细胞增殖的促进作用最强，与空白组比较，差异具有非常显著性意义（P0.01），即给药后2h血药浓度达到高峰。经每天在固定时间间隔给药2次、连续7d的方法可使血药浓度保持在较高水平内波动，药后0.5h至4h制备的含药血清对血管内皮细胞增殖具有较强的促进作用（均P0.01）。为了更准确地研究含药血清对血管内皮细胞增殖的促进作用，在以下的实验中均采用药后2h采血的方法制备含药血清。2.2血清灭活与否对血管内皮细胞增殖的影响表2结果表明，灭活与未灭活空白兔血清对血管内皮细胞

6、增殖的影响无显著性差异（P0.05）。灭活高剂量含药血清与未灭活高剂量含药血清对血管内皮细胞增殖都有显著的促进作用（P0.01），且后者作用强于前者（P0.05）。为了更准确地研究含药血清对血管内皮细胞增殖的促进作用，在以下的实验中均采用未灭活血清。2.3不同剂量的含药血清促进血管内皮细胞增殖的作用表3结果表明，骨炎定低、中、高剂量含药血清对血管内皮细胞增殖均有促进作用（P0.01），且呈现明显剂量效应关系。2.4骨炎定含药血清不同作用时间促进血管内皮细胞增殖作用的比较表4结果表明，未灭活空白兔血清能维持血管内皮细胞生长（P0

7、.05），未灭活高剂量含药血清在作用12、24、36h后对血管内皮细胞增殖均有显著的促进作用，且随着作用时间的延长，其促进作用增强（P0.01），呈现时间效应关系。3讨论骨性关节炎属于祖国医学“骨痹”范畴，其病因病机主要为久伤劳挫，瘀血阻络，肝肾亏损，筋骨虚弱，治疗以补肝肾，强筋骨，益气行血为原则。有研究表明各种致病因子所造成的全身或局部组织器官的缺血、缺氧、血循环障碍、血液流变性及粘滞性异常而导致的各组织器官水肿、炎症渗出、血栓形成、组织变性、结缔组织增生等一系列病理变化，均可概括在血瘀证的病理实质之中，而这些病变的中心环节

8、在于血管内皮细胞的变化［6］。活血化瘀法可降低骨内压［7］，改善骨性关节炎的症状［8］。且既往的研究及观察发现在胚胎时骨形成与血管生成密切相关［9］。所谓骨生发中心即位于血管化的环境中，而成骨细胞和骨祖细胞在新骨形成过程中总伴有毗邻血管内皮细胞存在。无论膜内成骨、软骨内成骨或