应用pva构建妊娠相关血浆蛋白a固相时间分辨荧光免疫试剂论文

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1、应用PVA构建妊娠相关血浆蛋白A固相时间分辨荧光免疫试剂论文［摘要］目的：合成(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+复合物，并用于构建妊娠相关血浆蛋白A固相时间分辨免疫荧光试剂。方法：用PVA作为载体结合BCPDAEu3+和生物素亲和素，以双抗体夹心法原理，结合生物素标记抗体和包被抗体建立PAPPA时间分辨免疫荧光试剂，并进行方法学评价。结果：成功的合成了活性的(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+复合物，构建PAPPA试剂检测灵敏度为0.7mIU/L；批内变异系数在3.89%～4.96%

2、之间,批间变异系数在7.35%～9.27%之间。结论：合成的(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+复合物较高的反应活性，可以用于多种试剂的构建。构建的PAPPA试剂灵敏度高，具有潜在的临床应用价值。［关键词］妊娠相关血浆蛋白A；固相时间分辨荧光免疫；亲和素—生物素—聚乙烯胺—4,7二氯磺苯基1.freeleresolvedFluoroimmunoassayReagentofPAPPAutilizingPVAAbstract:ObjectiveTodevelopadirectsolidphaselanthanet

3、imeresolvedfluoroimmunoassayreagentofPAPPAbysynthesizingaplexof(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+.MethodsPolyvinylamine(PVA)chelateof4,7bis(chlorosulfophenyl)1,10phenanthroline2,9dicarboxylicacid(BCPDA).UsinglabeledPVAplex,的碳酸盐(pH9.1)缓冲液配制浓度为10mg/ml聚乙烯胺(PVA)溶液，将200μgNH

4、SLCLCBiotin溶于20μl碳酸盐缓冲液中，取200μl上述PVA溶液加入20μl上述NHSLC—LCBiotin溶液中，振荡混匀，室温反应1.5h(PVA∶Bio=1∶15)，用0.5M碳酸盐缓冲液将混合液稀释到1ml，将固体BCPDA研磨成粉末状，先在上述1ml混合液中加入5mgBCPDA，用力搅拌，直到溶解，重复加3次BCPDA，5mg/次，共计20mgBCPDA，在室温放置5h～6h，直到溶液澄清，转移到透析袋中，用0.1MNaHCO35L透析、过夜、重复透析2次，尽可能除去没反应的BCPDA和生物素。1.2.3HP

5、LC纯化(Bio)xPVA(BCPDA)y复合物离心浓缩上述(Bio)xPVA(BCPDA)y复合物到0.3ml～0.5ml(用Amiconmicroconcentrationunits，MTris缓冲液(pH7.70)，控制HPLC流速0.8ml/min，在325nm处监测层析液(325nm为BCPDA最大吸收峰)，上样后，马上收集，(Bio)xPVA(BCPDA)y在10管～16管约5ml左右，取10μl(Bio)xPVA(BCPDA)y层析液加入90μl水滴入亲和素包被板微孔中，温育30min，洗板，加入用Tris缓冲

6、液配制的10M～5MEuCl3100μl，反应10min，洗板、干燥，用Tris缓冲液(pH7.8)配制小牛血清白蛋白(BSA溶液)60g/L，同时加入EuCl3，使Eu3+浓度为10-6mol/ml，用双蒸水配制亲和素溶液浓度为1mg/ml，取上述BSA溶液1ml，加入10μl亲和素溶液，再加入50μl的(Bio)xPVA(BCPDA)y复合物(通过固相免疫分析，棋盘滴定法确定最佳用量比，步骤略，结果见后)，混匀，55℃温育1.5h，4℃保存备用。1.2.5(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+复合物反应活性用生

7、物素化的各种浓度(0ng/50μl，0.5ng/50μl，5ng/50μl，50ng/50μl，100ng/50μl)鼠IgG包被96孔微板(同第7步)，用60g/LBSA和0.1mol/LTris缓冲液(pH7.8)10倍稀释(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+复合物，在板的微孔中加入100μl稀释后的(SA)z(Bio)xPVA(BCPDA)yEu3+复合物，室温反应30min，洗板、干燥，测量荧光强度(cpm)。本实验是验证复合物的反应活性。1.2.6生物素标记10E1抗体［12］用二甲亚砜制备硫代琥珀

8、酰亚氨6生物素氨基乙酯溶液(10mg/ml)，将抗体10E1溶于0.1mol/L硼酸钠溶液(pH8.8)，每1mg抗体中加硫代琥珀酰亚氨6生物素氨基己酯类溶液210μg混